多指標優化百合知母濃煎劑提取工藝△

陳麗，鄭艷萍

1.江蘇省中醫院，江蘇 南京 210029；2.南京海昌中藥集團有限公司，江蘇 南京 210061

百合知母湯[1]來源于漢代張仲景的《金匱要略》的古方，其方：百合七枚(劈)，知母三兩(切)，先水洗百合，漬一宿，當白沫出，去其水，更以泉水二升，煎取一升，去滓，別以泉水二升。煎知母，取一升，去滓后會和，煎取一升五合，分溫再服。

百合知母湯是中醫的金方，是中藥傳承的精華，具有養陰安神，清熱除煩之效?，F代藥理學研究表明，百合知母湯的黃酮類成分是治療更年期綜合征的有效成分之一[2]，其中芒果苷和新芒果苷是2個重要的黃酮類成分。百合是我們日常生活中常見的食療藥膳，藥食同源從古至今一直盛傳，現代藥理研究表明，百合具有抗應激損傷、抗氧化、鎮靜催眠[3]、促進免疫[4]、降血糖[5]、絕經綜合征[6]等藥理作用。知母其總多糖有降血糖[7]、抗炎作用[8]等。知母的活性成分先抑制Na+-K+-ATP酶，目的是減少組織內耗氧量，達到減少內熱的作用，通過提高實驗小鼠的耐氧能力，達到減慢心律、降低血糖[9]的作用，其中生品知母抑制Na+-K+-ATP酶活性的作用較強，現代藥理解釋了傳統中藥理論知母的滋陰清熱作用。因此本實驗以芒果苷和總多糖為研究指標，采用L9(33)正交試驗設計，系統研究了提取次數、加水倍數、提取時間3個因素對百合知母提取效果的影響，優選出最佳的提取工藝條件，為經典名方百合知母湯劑型改造和二次開發奠定了實驗基礎。

1 材料

1.1 儀器

Shimadzu LC-20AB高效液相色譜系統，包括在線脫氣系統、自動進樣器Prominence SIL-20A、二極管陣列檢查器SPD-M20A、柱溫箱CTO-20A(日本島津有限公司)；RE-52旋轉蒸發儀(瑞士步琪有限公司)；BS2242S電子天平(北京賽多利斯儀器系統有限公司)；KQ3200DB型數控超聲儀(昆山市超聲儀器有限公司)；UV-1800紫外-分光光度計(日本島津有限公司)；TGL-16C離心機(上海安亭科學儀器廠)。

1.2 試藥

芒果苷對照品(供含量檢測用，批號：111607-200402)、D-無水葡萄糖對照品(供含量檢測用，批號：110833-201205)均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均大于99.7%；乙醇、甲酸、硫酸、苯酚(分析純，南京化學試劑有限公司)；乙腈(色譜純，美國天地公司)；超純水(南京海昌中藥集團有限公司自制)。

百合產地湖南(批號：140721)、知母產地安徽(批號：141023)均來自南京海源中藥飲片有限公司，經南京海源中藥飲片公司丁菲中藥師鑒定符合《中華人民共和國藥典》2015年版一部百合、知母項下有關規定。

2 方法與結果

2.1 濃煎劑樣品的制備

稱取百合75 g、知母25 g置于2 L的圓底燒瓶中，加水浸泡30 min，置于電熱套加熱回流，燒開后保持微沸，開始計時，結束后過濾，濾渣加入圓底燒瓶中再按上面方法提取，合并所有提取藥液，再將藥渣充分壓榨，壓榨出的藥汁并入上述藥液，用旋轉蒸發儀濃縮至為體積100 mL，即為百合知母湯的濃煎劑樣品，置于4 ℃存放備用。

2.2 芒果苷的檢測

2.2.1色譜條件 YMC-C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相：乙腈-0.2%甲酸水溶液，流速：1.0 mL·min-1，10%乙腈等度洗脫，檢測波長：258 nm，進樣量：10 μL，柱溫：35 ℃，采樣時間35 min。理論板數按芒果苷峰計算應不低于3000。

2.2.2溶液的制備 對照品溶液：取芒果苷對照品適量，精密稱定0.95 mg，置10 mL的容量瓶中，加乙醇定容至刻度線，制成質量濃度為0.095 mg·mL-1的溶液備用。

供試品溶液：取百合知母湯濃煎劑樣品1 mL，加入到10 mL的容量瓶中，用乙醇定容到刻度，充分搖勻后，50 ℃水浴熱溶解30 min，靜止10 min，用乙醇定容后，搖勻取上清液，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得。

2.2.3系統適應性試驗 取2.2.2項下制備對照品溶液及供試品溶液，按2.2.1項下檢測條件分析，進樣量為10 μL，見圖1。

注：A.對照品；B.供試品；C.空白溶劑；1.芒果苷。圖1 百合知母湯濃煎劑HPLC圖

2.2.4線性關系考察 精密吸取質量濃度為0.098 mg·mL-1芒果苷對照品溶液，用乙醇稀釋，分別制成質量濃度為9.8、19.6、39.2、58.8、98 μg·mL-1對照品溶液，按照2.2.1的色譜條件進行測定，以峰面積(Y)和對照品質量濃度(X)進行回歸，計算得回歸方程：Y=4×107X+5681，r=0.999 7。說明芒果苷在9.8～98 μg·mL-1與峰面積成良好的線性關系。

2.2.5精密度試驗 精密取2.2.2項下混合對照品溶液，按2.2.1項下色譜條件重復進樣6次，記錄峰面積值，計算芒果苷峰面積的RSD為0.53%，說明分析設備精密度良好。

2.2.6重復性試驗 取同批混合均勻的百合知母湯濃煎劑6份，按照2.2.2方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜條件測定，記錄各個色譜峰面積，計算芒果苷峰面積的RSD為1.66%，說明試驗的分析方法重復性良好。

2.2.7穩定性試驗 取同批混合均勻的百合知母湯濃煎劑供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24 h進樣，按2.2.1色譜條件測定，記錄各個色譜峰面積，計算芒果苷峰面積的RSD為1.76%，說明供試品溶液在24 h內穩定性較好。

2.2.8加樣回收率試驗 分別精密量取已知含量的同一批混合均勻的百合知母湯濃煎劑1 mL各6份，按照表1添加芒果苷對照品，按照2.2.2方法制備供試品溶液，按2.2.1色譜條件測定，測定峰面積，計算加樣回收率，見表1。結果表明濃煎劑芒果苷回收率為99.71%，RSD為2.36%，加樣回收率符合要求。

表1 百分別知母湯芒果苷加樣回收率試驗(n=6)

2.3 總多糖的含量測定

2.3.1標準曲線的制備 精密稱取61.0 mgD-無水葡萄糖對照品置于100 mL容量瓶中，加純化水定容，制成質量濃度為0.61 mg·mL-1的D-無水葡萄糖對照品溶液[10]。精密量取配置好的D-無水葡萄糖對照品溶液1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，分別置于50 mL容量瓶中，加水定容至刻度線，搖勻，精密量取上述溶液2 mL，置具塞試管中，分別加入4%苯酚溶液1 mL，混勻，迅速加入硫酸7.0 mL，搖勻，于40 ℃水溶液中保溫30 min，取出，置冰水浴中5 min，取出，以相應試劑為空白，照紫外-分光光度法，在490 nm的波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(Y)，濃度(X)為橫坐標計算回歸方程Y=47.845X-0.083 3，r=0.999 7，質量濃度為2.44～7.32 μg·mL-1線性關系良好。

2.3.2樣品中總多糖的含量測定 精密量取百合知母湯濃煎劑，精密量取2 mL，加乙醇10 mL，攪拌，4000 r·min-1(離心半徑為20 cm)離心10 min，去除上清液，取沉淀加水溶解，置50 mL容量瓶中，并稀釋到刻度線，搖勻，精密量取2 mL，參照2.3.1項下D-無水葡萄糖標準曲線的制備方法，自“4%苯酚溶液1 mL”起制備，依法測定吸光度，按照標準曲線回歸方程計算供試品總多糖含量(以葡萄糖計)。

2.4 百合知母湯濃煎劑正交試驗

依據預試驗單因素考察的結果，采用正交試驗法對百合知母藥材的提取工藝進行優選。以提取時間(A)、提取次數(B)、加水倍數(C)為考察因素，每個因素選取3個水平，百合知母湯提取工藝因素水平見表2。以百合知母中的2個活性成分芒果苷和總多糖的含量作為評價指標，綜合評分總分為1，根據藥效成分確定芒果苷和總多糖權重分別為0.5、0.5。在此基礎上進行總加權評分，利用綜合的評分值[11](W)對實驗的結果進行分析：以各指標的最大值(Amax)作為參照對同一指標的各數據進行標準化處理，D表示實驗中該指標成分測定值的標準化數據(D=A/Amax)結果見表3～4。

綜合評分W=D芒果苷×0.5+D多糖×0.5

(1)

表2 百合知母湯提取因素水平

表3 百合知母湯提取正交試驗

表4 百合知母湯提取正交試驗方差分析

注：F0.05(2，2)=19.00；F0.01(2，2)=99.00。

從表3、4可以看出因素之間差異無統計學意義，表3結果表明：影響百合知母湯濃煎劑提取工藝的因素依次是B>A>C；進一步分析：提取次數因素各水平影響大小順序為B3>B2>B1；提取時間因素各水平影響大小順序為A3>A1>A2；加水倍數因素各水平影響大小順序為C1>C2>C3；通過方差對比分析A、C對正交試驗結果影響差異無統計學意義，所以以芒果苷的含量和多糖的含量綜合評價得最佳的提取工藝為A3B3C1，但考慮節省時間選擇A3B2C1，即提取時間3 h，提取次數2次，加水倍數10倍為最佳。

2.5 最佳提取工藝的驗證實驗

為進一步考察所選取工藝條件的可靠性及穩定性，按照原來的百合知母顆粒劑制備的處方擴大3倍稱取3份，按照A3B2C1最優提取工藝進行驗證實驗，操作的方法同2.1，結果見表5。

表5 百合知母顆粒劑提取工藝驗證

根據驗證結果表明，正交試驗設計得出的最佳提取工藝適合百合知母提取生產實踐，方法具有可操作性。

3 討論

3.1 水的用量

在本實驗的預試驗中分別加水8、10、12、14倍，發現隨著加水量的增大，百合知母的提取液中芒果苷的含量先上升然后下降，說明水的使用在實際的生產中不能太多也不能太少，要適當，這樣才能使百合知母湯劑有效成分最大限度提取出來。

3.2 流動相的選擇

本實驗流動相在參照《中華人民共和國藥典》的方法做一些改動，《中華人民共和國藥典》為乙腈-0.2%冰醋酸水溶液，實驗中發現基線沒有乙腈-0.2%甲酸水溶液穩，出峰尖。所以最后選定后者，且10%乙腈等度洗脫。

3.3 指標成分選取

本實驗選擇芒果苷和總多糖作為優化指標。芒果苷和新芒果苷是知母里面2個重要的黃酮類成分，其任何一個成分的含量高低均可間接反應知母藥材的優劣[12]，考慮到實際生產中檢驗成本，只選用《中華人民共和國藥典》中規定的知母檢測指標芒果苷含量來反映知母藥材優劣；百合中含有大量的百合多糖，同時也是百合主要的藥效成分[4]，因此用總多糖來反映百合藥材的優劣。百合知母湯中2味中藥在本方中相互補充，因此在綜合評分中各占50%來評價提取效果，保證百合知母濃煎劑的臨床藥效。

百合知母顆粒劑質量控制HPLC的檢測指標只有1個芒果苷的含量，今后可以研究多項指標控制[12]，更大程度地控制百合知母顆粒劑的質量。