HSP90抑制劑抑制糖酵解并促進(jìn)小鼠肝癌細(xì)胞系H22凋亡

劉娜斯，曹明月，吳友明，黃 薇，楊 楠，劉雁勇

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)學(xué)院 藥理學(xué)系，北京 100005)

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是最常見的惡性腫瘤之一，占原發(fā)性肝癌的90%，其發(fā)病率呈逐年增加的趨勢(shì)，尤其在中國[1]。研究表明，在肝損傷初期，細(xì)胞主要通過氧化磷酸化途徑提供ATP，當(dāng)肝癌進(jìn)展至中晚期時(shí)，細(xì)胞傾向于通過糖酵解途徑獲取能量，而糖酵解與HCC的進(jìn)展和預(yù)后不良密切相關(guān)[2]。已有研究證明藥物可通過抑制腫瘤的糖酵解途徑從而發(fā)揮抗腫瘤作用[3]。

臨床上糖皮質(zhì)激素常作為HCC的輔助治療藥物，其通過作用于細(xì)胞內(nèi)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GR)發(fā)揮對(duì)糖代謝的調(diào)節(jié)作用，而GR的正確折疊依賴于熱休克蛋白HSP90(heat shock proteins, HSPs)的分子伴侶功能[4]。HSP90是一種廣泛存在于微生物和動(dòng)植物體內(nèi)的應(yīng)激蛋白，可提高細(xì)胞的應(yīng)激能力，其在HCC中高表達(dá)，且與HCC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[5]。盡管近年來關(guān)于肝癌生物代謝的研究越來越多，但HSP90抑制劑對(duì)HCC糖代謝調(diào)節(jié)的具體機(jī)制尚不完全明確。因此，本研究擬利用GR拮抗劑RU486和HSP90抑制劑17-AAG，在細(xì)胞水平對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞系H22細(xì)胞的糖酵解和凋亡水平進(jìn)行評(píng)價(jià)，并對(duì)其調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行探討，旨在為HCC提供新的治療策略和研究思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小鼠肝癌細(xì)胞系(mouse hepatocarcinoma cell line)H22(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所黃波教授課題組惠贈(zèng))。BCA蛋白定量試劑盒、ATP檢測(cè)試劑盒和annexinV-FITC/PI雙染凋亡檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司)；L-Lactate檢測(cè)試劑盒(Eton Bioscience公司)；HRP標(biāo)記的山羊抗兔抗體(ABclonal公司)；抗β-actin、H3、Akt、pAkt、PI3K和GR抗體(CST公司);糖皮質(zhì)激素受體(GR)拮抗劑RU486(上海陶素生化科技有限公司)和HSP抑制劑17-AG(Selleck公司)。

1.2 方法

1.2.1 ATP水平的檢測(cè)：將H22細(xì)胞分為對(duì)照組；皮質(zhì)酮(corticosterone，CORT)(1 μmol/L)；RU486 (3 nmol/L)；CORT+RU486；CORT+17-AAG (80 nmol/L)。收集處理48 h后的細(xì)胞，離心取細(xì)胞沉淀，加入裂解液裂解細(xì)胞，裂解后4 ℃ 12 000×g離心5 min，收集上清。ATP檢測(cè)按說明書操作。

1.2.2 L-lactate水平的檢測(cè)：H22細(xì)胞分組及細(xì)胞處理同1.2.1，乳酸檢測(cè)按說明書操作。

1.2.3 提取H22細(xì)胞核蛋白：分別用1 μmol/L CORT、3 nmol/L RU486、80 nmol/L 17-AAG或聯(lián)合給藥處理H22細(xì)胞 48 或72 h后，收集細(xì)胞提取核蛋白，具體操作步驟見參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.4 流式細(xì)胞計(jì)量術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡：分別用1 μmol/L CORT、80和160 nmol/L 17-AAG處理H22細(xì)胞。48 h后收集細(xì)胞，加入1×結(jié)合緩沖液500 μL制成單細(xì)胞懸液，加入5 μL annexinV-FITC室溫孵育5min后加入5 μL PI孵育15 min。流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析凋亡水平。

1.2.5 Western blot檢測(cè)H22細(xì)胞蛋白表達(dá)：收集并裂解H22細(xì)胞以提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，并調(diào)整至適宜濃度。每樣品取20 μg總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離后轉(zhuǎn)印至PVDF膜。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h后，4 ℃ 孵育一抗過夜。次日TBST洗膜后室溫孵育二抗1 h。再次TBST洗膜后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光，化學(xué)發(fā)光儀拍照后，用ImageJ 分析各條帶吸光度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 17-AAG通過抑制GR核轉(zhuǎn)位抑制H22細(xì)胞糖酵解

CORT處理顯著促進(jìn)H22細(xì)胞GR核轉(zhuǎn)位(P<0.05)(圖1A)，而與17-AAG或RU486共處理均可顯著抑制CORT誘導(dǎo)的GR核轉(zhuǎn)位(P<0.05)(圖1B,C)。

CORT處理后乳酸濃度顯著升高(P<0.05)。與CORT組相比，RU486或17-AAG與CORT共處理后乳酸水平分別下降了24%和23%(P<0.05)(圖1D)。同樣地，CORT處理后H22細(xì)胞ATP水平升高(P<0.05)，與RU486或17-AAG共處理后，ATP水平又分別下降了21%和17%(P<0.05)(圖1E)。

2.2 17-AAG誘導(dǎo)H22細(xì)胞凋亡

CORT對(duì)H22細(xì)胞凋亡水平無明顯影響，但17-AAG(80和160 nmol/L)處理后，與對(duì)照組相比，細(xì)胞總凋亡率分別升高了15.5%和34.0%，呈現(xiàn)劑量依賴性(P<0.05)(圖2)。

2.3 17-AAG抑制CORT誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路激活

H22細(xì)胞在經(jīng)過不同藥物處理后，PI3K和Akt的蛋白表達(dá)水平無明顯變化。CORT顯著上調(diào)pAkt表達(dá)水平(P<0.05)，當(dāng)與RU486或17-AAG共處理后，其表達(dá)水平分別降低了49%和44%(P<0.05)(圖3A)。

A.protein expression of GR in H22 cells after CORT (1 μmol/L) treatment for 48 or 72 hours; B.protein expression of GR in H22 cells after CORT (1 μmol/L) or RU486 (3 nmol/L) treatment; C.protein expression of GR in H22 cells after CORT (1 μmol/L) or 17-AAG (80 nmol/L) treatment; The relative protein levels were quantified by the intensity of bands using ImageJ software and normalized against β-actin; D-E.L-lactate and ATP assay in H22 cells after CORT(1 μmol/L), or combination treatment with RU486 (3 nmol/L) or 17-AAG(80 nmol/L) for 48 hours;*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with CORT group

圖1 17-AAG通過抑制GR核轉(zhuǎn)位抑制H22細(xì)胞糖酵解

3 討論

HCC是常見的消化系統(tǒng)腫瘤之一，患者病死率高且預(yù)后極差。糖代謝的改變是原發(fā)性肝癌的特征之一，表現(xiàn)為糖酵解活躍，代謝產(chǎn)物乳酸生成增多，以維持低pH的腫瘤微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。這種改變由多種復(fù)雜因素導(dǎo)致，并且與HCC的預(yù)后不良密切相關(guān)。研究表明，通過抑制糖酵解可以有效促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，抑制腫瘤生長[3]。

糖皮質(zhì)激素通過細(xì)胞內(nèi)受體調(diào)節(jié)細(xì)胞糖代謝過程，當(dāng)其與GR結(jié)合后，GR會(huì)從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)位進(jìn)入細(xì)胞核，通過結(jié)合糖皮質(zhì)激素反應(yīng)元件調(diào)控糖代謝相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄從而發(fā)揮生物學(xué)作用。GR的正確折疊依賴于HSP90的分子伴侶功能[7]。而HSP90抑制劑可導(dǎo)致未成熟的GR釋放繼而降解失活[8]。本研究利用生理濃度的CORT處理H22細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核中GR蛋白水平升高，表明CORT促進(jìn)GR轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核以發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。同時(shí)，CORT上調(diào)H22細(xì)胞糖酵解產(chǎn)物乳酸和ATP的水平，提示其可促進(jìn)H22細(xì)胞糖酵解。而當(dāng)CORT與RU486或17-AAG共處理后，CORT對(duì)GR核轉(zhuǎn)位以及糖酵解的促進(jìn)作用均被抑制，提示17-AAG可以抑制GR核轉(zhuǎn)位，從而阻斷糖皮質(zhì)激素發(fā)揮對(duì)糖酵解的調(diào)節(jié)作用。此外，細(xì)胞凋亡結(jié)果表明17-AAG可顯著上調(diào)H22細(xì)胞凋亡水平。由此表明17-AAG可通過抑制GR核轉(zhuǎn)位從而抑制糖酵解并促進(jìn)H22細(xì)胞凋亡。盡管在某些HCC患者的臨床治療中會(huì)使用外源性糖皮質(zhì)激素作為輔助藥物來抵消化療所帶來的副作用或改善患者的癥狀，但本研究的結(jié)果表明糖皮質(zhì)激素對(duì)H22細(xì)胞糖酵解存在促進(jìn)作用，這將有助于腫瘤細(xì)胞生存。因此，糖皮質(zhì)激素的使用有可能在HCC的輔助治療中產(chǎn)生負(fù)面作用，本研究結(jié)果將會(huì)對(duì)臨床HCC治療中的合理用藥提供理論依據(jù)以及一定的指導(dǎo)作用。

*P<0.05, **P<0.01 compared with control group

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with CORT group

PI3K/Akt信號(hào)通路能夠通過調(diào)節(jié)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞攝入葡萄糖從而加快糖酵解，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞存活[9-10]。Akt作為HSP90的客戶蛋白(client protein)，參與腫瘤生長增殖及遷移進(jìn)程，并可提高葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性，通過包括己糖激酶和磷酸果糖激酶在內(nèi)的糖酵解相關(guān)關(guān)鍵酶來促進(jìn)糖酵解及乳酸生成[11]。有研究者證明在前列腺癌中對(duì)Akt進(jìn)行抑制可有效阻斷GR的表達(dá)和活性。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)CORT可激活PI3K/Akt信號(hào)通路，上調(diào)pAkt蛋白表達(dá)水平，而與RU486或17-AAG共處理后pAkt表達(dá)降低，表明17-AAG能夠抑制CORT誘導(dǎo)的PI3K/Akt通路激活，提示對(duì)H22細(xì)胞糖酵解的抑制作用可能與PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)。

綜上所述，HSP90抑制劑17-AAG能夠通過抑制GR核轉(zhuǎn)位從而抑制糖酵解并促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路有關(guān)，這為HCC的治療策略提供了新的研究思路。