雷帕霉素下調(diào)mTOR-GP73通路抑制結(jié)直腸癌進程

張夢迪，王亞南，李 杰，浦 洋

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所 北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院 生理學系， 北京 100005)

結(jié)腸癌(colon cancer)是全球第三常見的癌癥，發(fā)病率隨著地區(qū)的發(fā)達程度而升高，多數(shù)患者確診時已屬于中晚期[1]。隨著我國居民的生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的西方化，結(jié)直腸癌(colorectal cancer)的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。因此，探究結(jié)直腸癌的治療手段以及發(fā)生發(fā)展的機制有重要意義。

高爾基蛋白73(Golgi membrane protein 73, GP73)負責協(xié)助在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上合成的蛋白轉(zhuǎn)運進高爾基體，在腸、胃、氣管、前列腺等器官呈高表達，而在心臟、肝臟、骨骼肌等組織中則呈低表達或幾乎不表達[3]。目前對GP73的大部分研究集中在其促進肝癌、肺腺癌等惡性腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移的作用上[3]。哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，有兩個不同的蛋白復合物的催化亞基，稱為mTORC1和mTORC2，mTOR信號通路的表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4]。結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展涉及多種信號通路，許多致癌通路都激活了mTOR信號通路，因此mTOR已經(jīng)成為治療結(jié)直腸癌的有效靶標[5]。本實驗室前期研究表明，mTORC1能上調(diào)GP73促進小鼠肝癌細胞的增殖和遷移[6]。雷帕霉素(rapamycin)是第1個已知的mTOR通路抑制劑[7]，本實驗室發(fā)現(xiàn)GP73促進人結(jié)直腸癌細胞的增殖，雷帕霉素可以通過抑制mTOR-GP73通路抑制結(jié)直腸癌發(fā)展。本研究揭示GP73在結(jié)直腸癌中的作用機制，并為雷帕霉素可以作為GP73高表達的結(jié)直腸癌患者的靶向藥物提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物：SPF級C57/B6雄性小鼠(中國醫(yī)學科學院實驗動物中心)，本研究已獲得北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院倫理委員會的批準(審批編號：002-2012)。

1.1.2 細胞系：人結(jié)直腸癌細胞系Caco2、HT-29(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心)。

1.1.3 主要試劑：胰蛋白酶、胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(Hyclone公司)；β-actin一抗(Santa Cruz 公司)；GP73一抗(Protein Tech公司)；磷酸化核糖體蛋白S6(phospho-ribosomal protein S6, p-S6)和EIF4E結(jié)合蛋白(EIF4E-binding protein, 4EBP1)一抗(Cell Signaling Technology公司)；兔抗和鼠抗的二抗(ABclonal公司);葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium salt, DSS)(MP Biomedicals公司)；雷帕霉素(華北制藥有限公司)；氧化偶氮甲烷(azoxymethane,AOM)(Sigma-Aldrich公司)；蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑(Roche公司)；CCK-8試劑盒(北京易盛生物醫(yī)藥科技公司)。

1.2 方法

1.2.1 TCGA突變數(shù)據(jù)庫分析：使用Gene Expression Profiling Interactive Analysis(GEPIA)網(wǎng)站(http://gepia.cancer-pku.cn/)，分析人結(jié)直腸癌組織中的基因表達。

1.2.2 敲低細胞株的構(gòu)建：靶向敲低人GP73的慢病毒由上海吉凱基因有限公司合成。接種靶細胞后，培養(yǎng)至細胞合適匯合度(20%～30%)，更換培養(yǎng)基后加入病毒液和感染增強液，感染效率通過綠色熒光蛋白的表達來初步判定。

1.2.3 克隆形成：將2 000 個Caco2及4 000 個HT-29 細胞鋪于10 cm 培養(yǎng)皿中，Caco2細胞于鋪完16 d、HT-29 細胞鋪完21 d棄去上清，PBS 潤洗后，甲醇固定15 min，0.5%結(jié)晶紫染色15 min，拍照并統(tǒng)計克隆數(shù)目。每種細胞平行鋪3 個培養(yǎng)皿。

1.2.4 細胞增殖實驗：將2 000個細胞E接種在96孔板中，加入對應的培養(yǎng)基，每組5個復孔。一定時間后，使用CCK-8試劑盒評估細胞活力，在450 nm波長下檢測吸光度(A)值，吸光度倍數(shù)變化=該時間點的吸光度/培養(yǎng)0 h后的吸光度。藥物的抑制率=(1-實驗組吸光度/對照溶劑組吸光度)×100%。

1.2.5 蛋白質(zhì)提取和蛋白質(zhì)免疫印跡檢測：用超聲研磨儀研磨組織后，用含蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液裂解組織蛋白質(zhì)，98 ℃金屬浴加熱10 min。取30～40 g蛋白加入SDS-聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，利用轉(zhuǎn)膜儀將蛋白轉(zhuǎn)入PVDF膜，最后使用全自動化學發(fā)光成像系統(tǒng)得到蛋白條帶。將β-actin表達蛋白質(zhì)檢測水平作為對照。使用ImageJ軟件分析條帶的灰度值并計算相對灰度值。

1.2.6 小鼠的取材和病理切片的制作：脫臼處死小鼠后，取小鼠的結(jié)腸至肛門段，并放于黑色背景上拍照。蘇木精伊紅(HE)染色病理切片由武漢谷歌生物有限公司制作。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 GP73在人結(jié)直腸癌樣品中高表達

與人的正常結(jié)直腸癌組織相比，人結(jié)腸腺癌和直腸腺癌組織中的GP73顯著高表達(P<0.05)(圖1)。

2.2 GP73的下調(diào)抑制人結(jié)直腸癌細胞系增殖

使用慢病毒GV115載體系統(tǒng)在HT-29和Caco2細胞中構(gòu)建GP73敲低的細胞株，蛋白免疫印記實驗表明，與陰性對照(轉(zhuǎn)染scrambled control-shRNA, sc-shRNA)細胞相比，GP73的蛋白表達水平顯著降低(P<0.001)(圖2A, C)。CCK8細胞增殖實驗顯示， shGP73-HT-29和shGP73-Caco2細胞株與陰性對照組相比，細胞增殖能力顯著降低(P<0.05)(圖2B, D)。克隆形成實驗顯示， shGP73-HT-29和shGP73-Caco2細胞株與陰性對照組相比，集落形成能力明顯降低(P<0.001)(圖3A, B)。

GP73 expression in colonic tumor tissues from human CRC patients compared with that in normal tissues using expression data from the TCGA database

sh.short hairpin RNA; sc.scrambled control-shRNA; A.Western blot was used to analyze GP73 expression levels inGP73-deficient HT-29 cells and control cells; B.cell proliferation assays inGP73-deficient HT-29 cells and control cells; C.Western blot was used to analyze GP73 expression levels inGP73-deficient Caco2 cells and control cells; D.cell proliferation assays inGP73-deficient Caco2 cells and control cells;*P<0.05,**P<0.01 compared with control cells

圖2GP73的下調(diào)抑制人結(jié)直腸癌細胞系增殖

A.GP73 knockdown suppressed the colony formation of HT-29 cells; B.GP73 knockdown suppressed the colony formation of Caco2 cells;*P<0.001 compared with control cells

圖3GP73的下調(diào)抑制人結(jié)直腸癌細胞系集落形成

2.3 GP73缺失的shGP73-HT-29細胞對雷帕霉素的治療不敏感

CCK8細胞增殖表明，經(jīng)過10 nmol/L雷帕霉素處理24、48、72 h后，雷帕霉素對shGP73-HT-29細胞株的增殖抑制率顯著低于陰性對照細胞(P<0.05)(圖4)。

GP73-deficient HT-29 cells and control cells were incubated with rapamycin; absorbance at 450 nm was detected using CCK8 assay, and percent suppression of proliferation as calculated as(Acontrol-Atreatment)/Abcontrol; *P<0.05， **P<0.01 compared with control cells

2.4 雷帕霉素通過mTOR-GP73通路抑制結(jié)直腸癌進程

對野生型小鼠使用氧化偶氮甲烷-葡聚糖硫酶鈉(AOM-DSS)誘導結(jié)腸炎相關的結(jié)腸癌(colitis-associated colorectal cancer,CAC)模型后，分別進行溶劑組和雷帕霉素治療(圖5A)。第81天時，雷帕霉素治療組的小鼠結(jié)直腸腫瘤數(shù)量和大小都顯著降低(圖5B)。HE染色顯示，第81天時雷帕霉素組的腫瘤惡性分化程度比溶劑組更高(圖5C)。蛋白免疫印跡實驗結(jié)果表明，與溶劑組相比，雷帕霉素組中mTOR通路中的p-S6和4EBP1顯著降低(P<0.01)，GP73蛋白水平也顯著降低(P<0.05)(圖5D)。

3 討論

結(jié)直腸癌作為發(fā)病率第三高的癌癥，盡管醫(yī)療水平取得了很大進步，結(jié)直腸癌的治愈率和長期存活率幾乎沒有變化[8]。因此，深入研究結(jié)直腸癌，探索新的靶向藥物和綜合療法非常必要。

A.a schematic of the strategy to administer rapamycin and AOM-DSS treatment; B.representative images of colon tumors from AOM-DSS treated mice followed by rapamycin administration; C.representative images of HE-stained colons from rapamycin/vehicle-AOM-DSS-treated mice sacrificed on day 81 (scale bar=1 000 μm); D.tumor tissues from rapamycin/vehicle-AOM-DSS-treated mice were analyzed by Western blot with the indicated antibodies and relative gray values were analyzed by Image J;*P<0.05，**P<0.01 compared with vehicle group

圖5 雷帕霉素通過mTOR-GP73通路抑制結(jié)直腸癌進程

Fig 5 Rapamycin inhibited colorectal cancer through mTOR-GP73 pathway

多項研究表明， GP73作為一種高爾基體糖蛋白，是一種新的腫瘤標志物，在肝細胞癌、肺癌、乳腺癌等惡性腫瘤中上調(diào)，并與預后相關[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，GP73在人結(jié)直腸癌組織中高表達，提示GP73可能有促癌作用。本研究的增殖實驗結(jié)果和克隆形成結(jié)果也驗證了這一猜想，GP73可以促進人結(jié)直腸癌細胞系的增殖。

雖然GP73近年來作為一種腫瘤標志物受到關注，然而關于GP73的機制，特別是靶向治療方面知之甚少[3]。為了滿足癌細胞對增殖的高要求，癌細胞通常在營養(yǎng)攝取和能量代謝方面發(fā)生根本性改變，這些過程直接受mTORC1途徑控制[9]。但是在很多案例中，選擇性靶向mTORC1的藥物(如雷帕霉素)的療效受到限制[7]。因此，尋找mTOR通路在腫瘤中更下游的分子機制，為雷帕霉素的治療提供更精準的策略非常重要。本實驗室之前的研究證明了mTOR通路和GP73在肝癌中的相關性，并證明了腫瘤中GP73的豐度與腫瘤對雷帕霉素的敏感性成正比[4]。本研究中，GP73豐度更高的結(jié)直腸癌細胞系對雷帕霉素的治療更敏感，說明了雷帕霉素可能通過GP73對腫瘤的增殖進行抑制。

為了模擬人體內(nèi)的結(jié)直腸癌進程，本研究構(gòu)建了化學誘導的小鼠結(jié)直腸癌模型(AOM-DSS結(jié)腸炎相關的結(jié)腸癌模型)[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可以降低腫瘤組織中GP73的表達，有效減緩結(jié)直腸癌的進程。

本研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)直腸癌細胞內(nèi)mTOR信號通路與GP73的關聯(lián)可以為結(jié)直腸癌的治療提供了新的分子機制。值得注意的是，本研究中揭示的雷帕霉素對結(jié)直腸癌的治療敏感性與GP73豐度正相關的現(xiàn)象，說明GP73水平的高低可以作為治療結(jié)直腸癌時是否選用雷帕霉素的依據(jù)。

綜合以上結(jié)果，本研究首次揭示了雷帕霉素通過mTOR-GP73通路抑制人結(jié)直腸癌細胞系增殖，并在動物模型中驗證了這一發(fā)現(xiàn)，提示了臨床治療中雷帕霉素可以作為GP73高表達的結(jié)直腸癌患者的潛在治療方案。