高密度脂蛋白改善膠原誘導性關節炎模型小鼠的癥狀

王 昕，董慶喆，張 娟，李 冬，艾 迪，王云龍*

(1.青島大學附屬醫院 生物標本庫， 山東 青島 266000； 2.青島大學 藥學院， 山東 青島 266021；3.青島大學附屬醫院 小兒外科， 山東 青島 266000； 4.青島大學附屬醫院 泌尿外科， 山東 青島 266000)

類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis, RA)是一種比較常見的慢性自身免疫性疾病，發病率約為0.5%～1%，發病人群以老年人居多。RA病理表現為持續性的關節疼痛、腫脹、僵硬，滑膜增生，血管翳的生成，關節和骨組織破壞，甚至造成殘疾并引起多種并發癥[1-3]，給患者造成了極大地經濟負擔，嚴重影響其生活質量。

高密度脂蛋白(high-density lipoprotein，HDL)是由物理化學性質與功能性質不同的脂質和脂蛋白所構成的復合體[4]，它的蛋白組分包含載脂蛋白、酶、脂質轉移蛋白、急性期反應蛋白等[5]。除具有抗動脈粥樣硬化作用，HDL還發揮抑制血栓形成、抑制低密度脂蛋白的氧化、改善內皮細胞功能障礙、中和機體內毒素、免疫調節、抗感染及臟器保護等作用[6-8]。有證據表明，HDL的數量、結構組成和功能在RA患者中都發生了改變[9]。而且治療RA的藥物甲氨蝶呤和英夫利昔單抗在緩解RA患者關節炎癥狀的同時，對于HDL的功能也有所改善[10]。因此，HDL極有可能對于RA有積極的作用，因此本研究應用膠原蛋白誘導建立類風濕性關節炎小鼠模型，探討HDL對于類風濕性關節炎的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：冰醋酸(國藥集團化學試劑有限公司)；牛Ⅱ型膠原(Chondrex公司)；弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑(Sigma-Aldrich公司)；HDL(ProSpec公司)；福爾馬林固定液、EDTA(北京索萊寶科技有限公司)；ELISA試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)。

1.1.2 實驗動物:SPF級雄性 DBA/1小鼠，6周齡，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，飼養于青島大學附屬醫院醫學動物實驗室。動物中心許可證編號：SYXK(魯)-20150003。

1.2 方法

1.2.1 膠原誘導性關節炎(collagen induced arthritis，CIA)小鼠模型的建立及實驗分組：使用2.5 mL 0.01 mol/L無菌醋酸稀釋10 mg牛Ⅱ型膠原，終濃度為4 g/L，將稀釋好的牛Ⅱ型膠原避光置于4 ℃旋轉過夜直至膠原完全溶解。造模前取等量濃度為2 g/L牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑于冰上充分乳化制成膠原乳劑。

將DBA/1小鼠隨機分為對照組、CIA組和CIA+HDL組，每組6只，CIA組與CIA+HDL組均需建立CIA模型。第0天，在小鼠尾根部皮內注射100 μL牛Ⅱ型膠原與弗氏完全佐劑制成的膠原乳劑。為了加強免疫效果，CIA組與CIA+HDL組在第21天注射牛Ⅱ型膠原與弗氏不完全佐劑制成的膠原乳劑100 μL，對照組注射0.9%氯化鈉溶液。

1.2.2 小鼠體質量測量與關節炎評分標準:實驗期間定期測定小鼠體質量并進行關節炎評分。關節炎評分標準如下：對于單只爪子，以0～3的評分標準測定關節炎嚴重性。0為正常狀態，沒有炎性反應或發紅；1為1個手指或足趾發紅和腫脹；2為>1個手指或足趾的紅腫，或者1個手指或足趾、踝關節、腕關節發紅和腫脹；3為所有手指或足趾和關節發紅和腫脹[單只小鼠評分:(0～3)分×4(爪)=(0～12)分]。

1.2.3 HDL給藥方案:CIA + HDL組在小鼠發病后通過尾靜脈注射HDL(10 mg/kg體質量)，每3 d給藥1次，共注射5次。對照組靜脈注射與CIA組相同體積的0.9%氯化鈉溶液。

1.2.4 ELISA檢測TNF-α和IgG2α水平:在第75天麻醉后處死小鼠，摘取小鼠眼球收集血液，室溫靜置2 h，3 000 r/min離心10 min，收集血清。按照ELISA試劑盒說明測定TNF-α和IgG2α的水平。

1.2.5 小鼠踝關節病理分析:在第75天麻醉后處死小鼠，將各組小鼠后足在10%中性甲醛緩沖液中固定，10% EDTA溶液中浸泡1個月進行脫鈣，石蠟包埋，組織切片用HE染色。使用Nikon TE2000-S進行圖像分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 HDL對CIA小鼠體質量及臨床評分的影響

3組小鼠的體質量在第60天之前較為接近，第60天后，CIA組小鼠體質量明顯輕于對照組與CIA+HDL組小鼠(圖1)。

圖1 小鼠體質量變化趨勢圖

造模第40天，小鼠陸續開始發病，實驗組小鼠發病后靜脈注射HDL進行治療，自加強免疫后記錄每只小鼠關節炎評分，對照組小鼠關節炎評分始終為零，CIA組與CIA+HDL組小鼠關節炎評分都顯著高于對照組(P<0.05)，說明模型建立成功。第50天開始，CIA+HDL組小鼠關節炎評分開始下降，并顯著低于CIA組(P<0.05)(圖2)。注射HDL治療的小鼠足爪腫脹程度明顯低于CIA組(圖3)。

*P<0.05 compared with CIA group

圖3 不同組小鼠足爪紅腫情況

2.2 HDL對小鼠血清炎性因子水平的影響

CIA組小鼠TNF-α水平(92.62±11.56)pg/mL明顯高于對照組(37.58±8.84)pg/mL(P<0.05)。與CIA組小鼠相比，CIA+HDL組小鼠的TNF-α水平(40.56±7.02)pg/mL顯著降低(P<0.05)(圖4)。

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with CIA group

2.3 HDL對小鼠血清IgG2α水平的影響

CIA+HDL組小鼠血清中IgG2α水平顯著低于CIA組(P<0.05)(圖5)。

*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with CIA group

2.4 HDL對小鼠踝關節組織病理的影響

對照組小鼠踝關節組織結構完整，關節軟骨面較為光滑，關節腔內無炎性細胞因子浸潤。與對照組相比，CIA組小鼠踝關節關節面粗糙，滑膜組織增生，關節腔內可見大量的炎性細胞浸潤；有血管翳生成，關節軟骨以及髓質也受到明顯的侵蝕。HDL治療的CIA+HDL組小鼠與CIA組相比較，關節面變光滑平整，滑膜增生、炎性細胞浸潤與骨侵蝕等病理變化明顯減輕(圖6)。

3 討論

本研究選用最為經典的CIA小鼠模型模擬人類RA，因為它們在病理表現、免疫等方面極為相似，模型小鼠的遺傳背景與人類相似，成本低廉，是研究人類RA早期、中期和晚期的發病機制以及治療方案極為有用的工具[11]。使用DBA/1小鼠造模后28 d觀察到小鼠陸續開始出現爪子腫脹現象，第40天小鼠全部發病，精神狀態不佳，小鼠外觀出現了不同程度的關節炎癥狀，例如關節腫脹、僵硬畸形，說明造模全部成功。靜脈注射劑量為10 mg/kg HDL 5次后，小鼠關節炎臨床評分明顯降低。

在RA患者以及RA動物模型中證實了TNF-α是RA的致病機制中的關鍵細胞因子，由滑膜巨噬細胞產生。TNF-α作為主要的炎性因子參與炎性反應過程并引起系統性的炎性反應，因此對類風濕性關節炎的疾病發展以及嚴重程度具有重要影響。應用TNF-α阻斷劑可以降低RA患者中滑膜組織中TNF-α的表達，從而改善RA患者的癥狀[12]。目前抑制TNF-α是治療RA疾病的有效手段。CIA小鼠注射HDL治療后，血清中TNF-α的水平比CIA組降低了56.21%。極有可能是因為HDL及其清道夫受體BI(scavenger receptor class B type I,SR-BI)抑制了巨噬細胞上的免疫識別受體TLR4的表達，從而抑制巨噬細胞分泌炎性細胞因子[13]。同時，HDL的膽固醇逆轉運作用也會影響TLR向脂筏上的轉移，下調細胞表面表達量并對TLR介導的信號通路活性產生影響[14]。血清中特異性抗體IgG2α水平也與RA的病程與嚴重程度相關，CIA+HDL組比CIA組降低了21.76%。HE結果顯示HDL可以使CIA小鼠踝關節關節面變光滑平整，滑膜增生，炎性細胞浸潤與骨侵蝕等病理變化明顯減輕。

A.the ankle joint of control group; B.the ankle joint of CIA group; C.the ankle joint of CIA+HDL group

本研究結果表明HDL對于CIA小鼠有顯著的改善作用，為類風濕性關節炎的臨床治療以及新藥研發提供了新的思路及方向。其中涉及的多種免疫細胞的相互作用以及與炎性反應相關的信號通路還需進一步應用轉基因動物來驗證，從而最終明確高密度脂蛋白改善類風濕性關節炎的相關機制。