離軸拋物鏡掃描中繼系統提升雙光子顯微成像視場

姚 靖，吳 婷，葉世蔚，高玉峰，鄭 煒*，秦水介

(1.貴州大學 a.物理學院； b.貴州省光電子技術與應用重點實驗室， 貴陽 550025；2.中國科學院深圳先進技術研究院生物醫學光學與分子影像研究室， 深圳 518055)

雙光子顯微鏡(two-photon microscopy，TPM)具備快速、高分辨和三維成像能力，被廣泛地應用于生物醫學[1]、材料科學[2]和電子科學[3]等研究領域。隨著腦科學研究的逐漸升溫，雙光子顯微技術得到了進一步的發展。包括組織光透明[4]、自適應光學[5]等技術的開發使得TPM在小鼠腦內的縱向成像深度得到了很大的提高，但橫向視場卻主要限制在0.5 mm×0.5 mm左右，這種成像視場的局限使得TPM難以開展多腦區的神經活動成像研究。所以，如何實現大視場高分辨TPM成像已經成為了目前光學顯微成像領域的研究熱點之一[6-9]。

掃描系統設計對于實現大視場高分辨的雙光子成像起著至關重要的作用。檢流計振鏡可以靈活地控制掃描角，從而調節激光掃描區域的大小，這種特性使得它被廣泛地應用于TPM的二維掃描系統中。最早使用于TPM的二維掃描系統是由X方向和Y方向的兩片檢流計振鏡緊挨著構成的，中間沒有中繼光學系統[10,11]。這種設計比較簡潔，便于安裝調試，但是該方法無法使兩片振鏡同時共軛到物鏡后背孔徑處，所以不可避免地會使部分激光能量在掃描過程中損失掉。并且，由于受第一片掃描鏡的掃描角度的限制，第二片掃描鏡需要增大面積，從而限制了它的掃描速度[12]。在兩片檢流計振鏡中間加入提供中繼作用的透鏡系統能有效地解決上述問題，并且已經成為常見的TPM掃描系統之一[13-16]。但是，要滿足TPM大視場的成像需求，該掃描系統存在一系列技術難點，包括：1)現有的商業透鏡由于孔徑和焦距的限制，在大角度掃描的情況下，掃描光束很難全部通過共焦透鏡中繼；2)即使光束全部通過共焦透鏡中繼，但是隨著掃描角度的增大，透鏡共焦掃描中繼會產生較大的像差[9,17]，對系統的成像質量造成嚴重的影響，包括成像面的掃描光強沿視場徑向方向衰減，成像面不平整等；3)由于TPM需要飛秒激光作為光源，其一般為寬光譜系統。針對寬光譜，透鏡系統引入的色差會造成飛秒脈沖展寬，使得雙光子激發熒光信號急劇減弱[18]。目前，高端商業TPM會使用專門設計和加工的透鏡中繼系統，這能極大地改善以上問題，但是，其設計難度和加工成本較高，不適合于探索性為主的實驗室研究需求。如何在維持成像質量不變的前提下提升掃描范圍同時控制硬件成本仍是當前TPM掃描系統開發待解決的重點問題。

相對于透鏡中繼系統而言，反射鏡中繼系統具有天生的無色差優勢。美國Amos等[19]在90年代初就提出了利用共焦球面反射鏡作為中繼系統，并且申請了專利。該系統利用一對球面反射鏡共焦放置來實現掃描中繼，它很好地解決了中繼系統的色差問題，目前已經被廣泛地應用于需要更寬光譜的共聚焦顯微系統中。早期的雙光子顯微鏡也有用該系統作為中繼的，但是由于僅使用一對球面反射鏡，無法有效地補償像差，限制了雙光子成像視場，一般視場僅為0.5 mm × 0.5 mm左右[18,20]。Sharafutdinova等[20,21]的研究指出，相對于共焦球面反射鏡系統，離軸拋物鏡共焦系統能提供更好的掃描線性度和掃描光斑質量，預測該系統可以實現更高成像質量的共聚焦或雙光子成像。然而，該研究仍缺乏離軸拋物鏡共焦系統像差，如球差(spherical aberration)、掃描過程中邊緣視場的像散(astigmatism)、場曲(field curvature)和畸變(distortion)等的量化分析。至今為止，也沒有相關研究將離軸拋物鏡共焦系統與大視場雙光子成像技術結合，來實現高成像質量的視場直徑大于3 mm的雙光子成像。

在本文中，我們首先借助ZEMAX光學設計軟件(Copyright ? 2020 ZEMAX LLC. All rights reserved)進行仿真測試，在大掃描角度時，對離軸拋物鏡(off-axis parabolic mirror，OAPM)共焦掃描中繼系統與傳統的雙膠合透鏡(doublet lens,DB)式共焦掃描中繼系統光學性能的優劣進行理論分析對比。包括系統調制傳遞函數(modulation transfer function，MTF)分析，系統場曲、像散與畸變分析，系統球差分析以及物鏡聚焦后光斑點列圖與圈入能量的分析。其次，搭建了實際的光學系統，并測量比較了傳統的DB與OAPM共焦掃描中繼系統像面的聚焦光斑。最后，將OAPM掃描共焦中繼加入到自主搭建的雙光子顯微成像系統中，實現了2.4 mm×2.4 mm(視場直徑3.4 mm)的大視場小像差的成像，橫向分辨率為1 μm，縱向分辨率為11 μm。利用此顯微鏡，我們在2.4 mm×2.4 mm的大視場下能夠清晰地分辨小鼠大腦切片中微米量級的神經軸突結構。仿真結果和試驗結果均表明，OAPM中繼系統能有效地解決大視場掃描過程中由掃描系統引起的線性誤差和視場邊緣像差問題。值得一提的是，本文所涉及的所有光學部件都是現成商業光學元件，無需定制，能極大地縮減雙光子系統開發的時間和經濟成本。采用本文提出的離軸拋物鏡共焦掃描系統能為掃描顯微鏡技術研發提供較大便利。

1 材料與方法

基于OAPM的共焦掃描中繼系統ZEMAX模擬光路圖如圖1a所示。入射光經X振鏡(位于OAPM-1的焦點處)反射后，通過一對離軸拋物鏡(MPD229-M01，焦距f=50.8 mm，孔徑Φ=50.8 mm，Thorlabs，ZEMAX參數見表1)構成的中繼系統，共軛到Y振鏡(位于OAPM-2的焦點處)，再由一個F-theta矯正掃描透鏡(LSM54-850，焦距f=54 mm，Thorlabs)聚焦。使用多重態的方形反射鏡(X方向傾斜機械角為：0°，1°，…，6°)來模擬檢流計振鏡掃描過程，并進行MTF分析。使用視場角(Y方向視場角參數為：0°，2°，…，12°)來模擬振鏡掃描角，并進行像差與光斑屬性分析。入瞳位置放置于X-掃描振鏡面，入瞳直徑設置為5 mm，波長為760 nm。作為對照，傳統的DB共焦中繼系統ZEMAX模擬光路如圖1b所示，將OAPM共焦掃描中繼系統的OAPM組更換為雙膠合透鏡組(89683，焦距f=50 mm,孔徑Φ=40 mm，Edmund，ZEMAX參數見表2)，其余組件保持不變。

圖1 DB和OAPM掃描中繼系統結構示意圖Fig.1 DB and OAPM afocal scanning system setup(a)ZEMAX模擬OAPM共焦掃描中繼系統圖；(b)ZEMAX模擬DB共焦掃描中繼系統圖；(c)OAPM共焦掃描中繼像面光斑測量光路圖；(d)DB共焦掃描中繼像面光斑測量光路圖(a)Optical layout of the OAPM afocal scanning system in ZEMAX;(b)Optical layout of the DB afocal scanning system in ZEMAX;(c)Experimental setup of OAPM afocal scanning system;(d)Experimental setup of DB afocal scanning system

圖1c和1d是實際搭建的光學系統示意圖。圖中激光(Chameleon Ultra II，700～1 000 nm tunable，Coherent)出射后，通過4倍擴束系統(焦距f1=50 mm，f2=200 mm)進行擴束，其后放置一個直徑5 mm光闌，之后分別通過OAPM共焦掃描中繼系統和傳統DB共焦掃描中繼系統，再由F-theta矯正掃描透鏡進行聚焦，在掃描透鏡焦點處使用CCD(E3CMOS，3 072 pixels×2 048 pixels，ToupTek)進行光斑測量分析。

表1 ZEMAX模擬OAPM參數(mm)Tab.1 The parameter of OAPM in ZEMAX simulation (mm)

表2 ZEMAX模擬雙膠合透鏡參數(mm)Tab.2 The parameter of doublet lens in ZEMAX simulation (mm)

2 結果與分析

2.1 仿真結果與分析

2.1.1 場曲、像散和畸變分析

場曲、像散和畸變是系統像差的重要組成部分。場曲表示為子午(tangential,T)或弧矢(sagittal,S)光束的交點沿光軸方向到高斯像面的距離。像散則描述子午像點和弧矢像點在光軸上分開的距離。對于傳統的DB共焦掃描中繼系統，如圖2a所示，在像面，隨著掃描角度的增加，即沿+Y方向，場曲和像散逐漸增大，對比掃描角度為12°與0°(不掃描)時的情況，場曲造成的子午方向(T)軸向移動為-23.13 mm，弧矢方向(S)為-7.82 mm，子午(T)和弧矢(S)像點不重合造成的像散(子午場曲與弧矢場曲之差)為-15.31 mm。這表明了DB共焦掃描中繼系統在進行大掃描角度成像時會有極為嚴重的場曲和像散。該場曲會導致樣品面掃描場為大曲率的曲面，將嚴重影響成像質量。而子午像點和弧矢像點的不重合導致的像散，則導致樣品面焦點在某一方向拉長，在成像過程中造成X方向和Y方向的分辨率不等。

對于本文提出的OAPM掃描中繼系統中的場曲和像散，如圖2b所示，對比掃描角度為12°與0°(不掃描)時的情況，場曲造成的子午方向(T)軸向移動為+0.07 mm，弧矢方向(S)大致為-0.10 mm。子午(T)和弧矢(S)方向像點不重合造成的像散也僅為+0.17 mm左右。這證明了相比于傳統的DB系統，OAPM共焦掃描中繼系統在場曲與像散方面有了明顯的優化。

圖2 DB和OAPM掃描中繼系統的場曲和畸變曲線對比Fig.2 Comparison of field curvature and distortion profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼像面的場曲曲線；(b)OAPM共焦掃描中繼像面的場曲曲線；(c)DB共焦掃描中繼像面的畸變曲線；(d)OAPM共焦掃描中繼像面的畸變曲線 (a)The field curvature profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The field curvature profile in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)The distortion profile in the image plane of DB afocal scanning system; (d)The distortion profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

畸變是垂軸像差，不會影響像的清晰程度，只會改變軸外物點在像面的成像位置。在TPM中，系統的畸變會對掃描過程的線性造成影響，畸變越小，則掃描過程越趨于線性。從圖2c和2d中，可以看到兩系統的畸變對比，OAPM共焦掃描中繼系統的畸變(-1.57%)相比于傳統的DB共焦掃描中繼系統(-2.75%)也減小了將近1倍。所以，使用OAPM共焦掃描中繼作為雙光子顯微成像系統的掃描中繼系統，在掃描線性度方面能得到明顯的提升。

2.1.2 球差分析

球差是軸上點像差，即軸上點發出的同心光束經光學系統后，不再是同心光束，不同入射高度的光線經過光學系統后交光軸于不同位置，相對于近軸像點有不同程度的偏離，導致在高斯像面的像點不是一個點，而是一個圓形的彌散斑。球差會使本應該集中在中心位置處的能量彌散。在TPM中能量的彌散會造成分辨率下降以及信噪比降低。傳統的DB共焦掃描中繼和OAPM共焦掃描中繼的軸向球差曲線如圖3a和3b所示，OAPM共焦掃描中繼系統的球差僅是DB中繼系統的1/4左右。

圖3 DB和OAPM掃描中繼系統的軸向球差對比Fig.3 Comparison of spherical aberration profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼像面的軸向球差曲線；b)OAPM共焦掃描中繼像面的軸向球差曲線 (a)The longitude spherical aberration profile in the image plane of DB afocal scanning system;(b)The longitude spherical aberration profile in the image plane of OAPM afocal scanning system

2.1.3 調制傳遞函數MTF對比分析

調制傳遞函數MTF是成像光學系統像質評價的另一個重要指標。圖4為不同掃描角下的MTF曲線，其橫坐標表示空間頻率，單位為每毫米可分辨的線數。MTF值降為0時的空間頻率，稱為截止頻率，即系統分辨細節的能力。截止頻率越大，MTF曲線變化越平穩，空間頻率和MTF值圍成的面積越大，則系統的成像質量越好。

在傳統的DB共焦掃描中繼系統(圖4a)中，隨著振鏡掃描角的增大，系統能通過的截止頻率出現嚴重地下降。當掃描角增大到6°往上時，系統所能通過的空間頻率成分不足衍射極限的1/12，這時系統的成像性能已無法滿足成像的需求。這種情況在實際的掃描系統中會嚴重地影響到物鏡下聚焦光斑的形狀，導致這種情況的主要因素是當掃描角增大時，場曲增加，光束不能有效地聚焦在像面上，另外，由于子午弧矢方向焦點位置不同，像散增加，最終影響邊緣視場的熒光信號強度和成像分辨率。

然而，在本文提出的OAPM掃描中繼系統(圖4b)中，隨著振鏡掃描角度的增加，由于其對各類像差的優化，在各個掃描角的MTF曲線中，截止頻率和衍射極限曲線相同，各頻率成分的MTF透過率同衍射極限MTF相比只有極小的衰減。這說明在進行大視場掃描時，OAPM共焦掃描中繼系統的成像性能和不掃描時(0°)的基本相同，在TPM中使用OAPM共焦掃描中繼能顯著地提高成像質量。

2.1.4 中繼系統像面光斑分析

點列圖分析是另一種較為直觀的像質整體分析方式，主要通過像面聚焦光斑的形狀比較來觀察整個成像系統的優劣。通過DB共焦掃描中繼系統和OAPM共焦掃描中繼系統之后在像面的點列圖分別為圖5a和5b所示。對于傳統的DB共焦掃描中繼系統(圖5a)，隨著掃描角的增大，由于嚴重的場曲、像散以及球差等的影響，像面光斑的均方根(root-mean-square，RMS)半徑從0°視場角(衍射極限艾里光斑半徑為9.90 μm)的7 μm彌散至12°視場角時的588 μm。對于本文提出的OAPM共焦掃描中繼系統在像面的點列圖，即使在大掃描角度12°的時候，光斑的RMS半徑為7.09 μm，同衍射極限9.90 μm相近。與像面的光斑點列圖相對應，圖5c和5d分別為傳統的DB共焦掃描中繼系統和OAPM共焦掃描中繼系統的像面圈入能量圖。對于DB共焦掃描中繼系統，隨著掃描角的增大，聚焦光斑逐漸彌散；而對于OAPM共焦掃描中繼系統，即使大角度掃描時，聚焦光斑也基本上集中于艾里光斑內。

2.2 試驗結果與分析

2.2.1 中繼系統像面光斑形狀測量

實際系統很難精確測得各類像差的具體分量，考慮到我們設計中繼系統的最終目的是為了實現高分辨大視場成像，具體體現在雙光子成像系統上就是要求在樣品面上有較好的光學聚焦光斑，所以在實際試驗驗證系統中，我們通過測量不同掃描角的光斑形狀來對比模擬分析結果。我們搭建了如圖1c和1d所示的光斑測量系統，由測量系統得到不同掃描角下兩個中繼系統的光斑分布情況，如圖6所示。

圖4 DB和OPAM掃描中繼系統的MTF曲線對比Fig.4 Comparison of MTF profile between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦掃描中繼的MTF曲線；(b)OAPM共焦掃描中繼的MTF曲線 (a)The MTF profile of DB afocal scanning system;(b)The MTF profile of OAPM afocal scanning system

圖5 DB和OPAM掃描中繼系統的像面點列圖和圈入能量圖對比Fig.5 Comparison of the spot size and the energy in the image plane between DB and OAPM afocal scanning system(a)DB共焦中繼系統光斑的點列圖；(b)OAPM共焦中繼系統光斑的點列圖；(c) DB共焦中繼系統光斑的圈入能量圖；(d)OAPM共焦中繼系統光斑的圈入能量圖 (a)Spot diagram in the image plane of DB afocal scanning system;(b)Spot diagram in the image plane of OAPM afocal scanning system;(c)Enclosed energy in the image plane of DB afocal scanning system;(d)Enclosed energy in the image plane of OAPM afocal scanning system

圖6 CCD測得的DB和OAPM掃描中繼系統在不同掃描角度的像面焦點光斑圖Fig.6 Focus spots with different scanning-angle in the image plane of DB and OAPM afocal scanning system measured by CCD (a)在傳統的DB共焦掃描中繼系統中；(b)在OAPM共焦掃描中繼系統中 (a)In DB afocal scanning system; (b)In OAPM afocal scanning system

從實測結果也可以得出：在傳統DB共焦掃描中繼系統中，隨著掃描角度的增大，在包括場曲和像散以及球差等像差的影響下，聚焦光斑逐漸彌散；而對于OAPM共焦掃描中繼系統，隨著掃描角度的增加，聚焦光斑大小同不掃描時(0°)相差不大。通過試驗結果進行對比分析，進一步驗證了通過ZEMAX模擬分析得出的結論，在大角度掃描時，OAPM更適合作為TPM 的共焦掃描中繼。

2.2.2 高分辨率大視場雙光子成像結果

為了測試實際的OAPM共焦掃描中繼系統在雙光子顯微鏡中的光學性能，基于該共焦中繼系統，我們自主搭建了一臺大視場雙光子顯微成像系統(物鏡：XLPLN10XSVMP, 10× 0.6NA, Olympus；套筒透鏡：88596, 孔徑Φ=75 mm, 有效焦距EFL=200 mm, Edmund)。其余部分與OAPM共焦掃描中繼系統驗證光路相同。實際測得的最大視場為2.4 mm×2.4 mm(對應最大掃描角度12°)，遠大于常規雙光子顯微鏡約0.5 mm×0.5 mm的視場大小。實測橫向分辨率為1 μm，縱向分辨率為11 μm。通過該系統測量了Thy1-eGFP小鼠腦片，得到如圖7a所示的大視場圖像(激發波長為920 nm，圖像大小1 536 pixels×1 536 pixels)，并可以清晰地分辨出神經元軸突(圖7b)。試驗結果表明，通過OAPM共焦掃描中繼的光學矯正，可以在2.4 mm×2.4 mm的視場下清晰地采集到量級為微米的神經元軸突，為神經科學的研究提供了有效的成像技術手段。

圖7 使用OAPM掃描中繼的雙光子大視場成像結果，樣品為Thy1-eGFP小鼠腦片Fig.7 Two-photon microscopy imaging of Thy1-eGFP mouse brain tissue, the system was equipped with our OAPM afocal scanning system(a)2.4 mm×2.4 mm全視場圖；(b)在(a)圖中紅色框選區域，視場為0.8 μm×0.8 μm(a)The whole field-of view image, 2.4 mm×2.4 mm;(b)0.8 μm×0.8 μm field-of-view image at red box in(a)

3 討論

本項研究的主要目的是解決雙光子成像大視場掃描過程中由掃描系統引起的線性誤差和視場邊緣成像質量較差的問題。鑒于此目的，我們提出了一種基于離軸拋物鏡的共焦掃描中繼系統，可用于矯正TPM進行大視場成像時的邊緣視場像差。相比于傳統的DB共焦掃描中繼系統，OAPM共焦掃描中繼系統具備以下優勢：1)場曲、像散、畸變和軸向球差大幅減小；2)即使在大掃描角度下，MTF曲線仍然與衍射極限保持一致；3)像面光斑尺寸不隨掃描角度增大而增大，能量基本集中于艾里斑內。在實際的生物樣品成像試驗中，我們將OAPM共焦中繼整合到雙光子成像系統內，實現了對Thy1-eGFP小鼠腦片2.4 mm×2.4 mm(視場直徑3.4 mm)的大視場成像，并可清晰地分辨微米量級的神經軸突結構。

經典的幾何光學理論認為拋物面鏡的主要作用在于矯正軸上球差，對軸外像差幫助不大。這個觀點對于靜態光學成像系統而言是成立的，但是對于中繼掃描系統而言，需要特殊考慮。中繼掃描系統是一個動態的掃描過程，它的光軸隨著掃描角度的不同時刻在變化，換言之，中繼掃描系統是由多個不同的靜態系統組成的，每個靜態系統代表一個掃描角度。在這種情況下，拋物面反射鏡可以矯正場曲、像散和畸變，從而提升周邊視場的成像質量，增大成像視場。

具體而言， 場曲和像散的改善主要得益于巧妙的OAPM構架設計。OAPM中的拋物面反射鏡縱向為拋物線面型，橫向為球面面型，并且拋物面反射鏡的焦點也是球面鏡的焦點。入射平行光由位于拋物面反射鏡焦點處的X-掃描鏡投射到拋物面反射鏡上，并沿球面方向做橫向掃描。對于球面反射鏡而言，圓心處發出的小口徑平行光入射球面任何反射區域都是等價的，所以掃描過程中，橫向焦距基本不變。另外，由于縱向焦距有拋物面焦距決定并且在掃描過程中也基本不變，致使在掃描過程中，由縱向焦距和橫向焦距之差造成的像散得以緩解，從而解決了邊緣視場的像散問題。進一步，像散的優化直接造成場曲問題的解決，兩者是直接相關的。

而畸變對于掃描中繼系統而言，則是由中繼系統對掃描角度的線性保持情況來決定的。通俗地講，如果掃描過程中，中繼系統的輸出角度和輸入角度是線性對應關系，則不會產生畸變，反之則會產生畸變。由于我們的OAPM中繼系統是由兩片拋物面鏡對稱放置且嚴格共焦，由幾何光學可知，光束在OAPM-1表面產生的角度偏移(平行光匯聚點相對于理想焦點的偏移)同其在OAPM-2表面產生的角度偏移大小相等且方向相反，該掃描方式造成在OAPM-1掃描產生的弧形畸變和OAPM-2產生的弧形畸變之間相互抵消，從而優化了成像系統的畸變情況。

需要指出的是，雖然該OAPM共焦中繼系統在大掃描角度下能對場曲、像散、畸變和球差進行矯正，但是對彗差的矯正效果不明顯，這主要是由拋物面反射鏡中拋物線的性質決定的。彗差會造成成像分辨率的下降及成像信號的減弱，這也是目前在OAPM共焦中繼系統中限制成像視場進一步增大的主要原因之一。在今后的工作中，我們建議可以通過引入透鏡組來補償彗差,從而進一步優化該OAPM掃描中繼系統,或通過自適應光學補償等手段來進一步提高視場邊緣的成像質量。

綜上所述，本文提出了一種基于離軸拋物鏡的共焦掃描中繼系統，該系統能有效矯正TPM進行大視場成像時的球差以及掃描引起的像散、場曲、畸變等像差，從而提高視場邊緣成像分辨率以及雙光子熒光強度。本項研究結果可應用于所有雙光子顯微成像系統中，有助于推進腦科學研究中多腦區甚至全腦區神經活動的成像研究。