絲裂原活化蛋白激酶4通過激活AKT促進宮頸癌細胞增殖

賴麗梨，段華英，鄒爭志

(1.廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產科， 廣州 511300； 2.廣州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科， 廣州 510260；3.華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學教育部重點實驗室， 廣州 510631; 4.華南師范大學生物光子學研究院， 廣東省激光生命科學重點實驗室， 廣州 510631)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)是一個能被不同的細胞外刺激激活的絲氨酸-蘇氨酸蛋白激酶家族，細胞外的因素包括細胞生長因子、神經遞質、激素、細胞應激及細胞黏附。MAPK信號通路是真核生物信號傳遞網絡中的重要途徑之一，在基因表達調控和細胞功能活動中發(fā)揮著關鍵作用。經典的MAPK家族可分為ERK、p38、JNK和ERK5 4個亞族。已知MAPK這4個家族成員在細胞的生長、分化、對環(huán)境的應激適應、炎癥反應等多種重要的細胞生理/病理過程中發(fā)揮著重要的作用。MAPK家族的過度激活在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，MAPK的激活與腫瘤細胞的增殖、轉移和遷移有重要關系[1]。MAPK4是MAPK家族的一個非典型的成員，關于MAPK4的生物學功能以及與疾病的關系，目前報導的很少。有研究發(fā)現(xiàn),MAPK4能夠通過調節(jié)MAPK5的功能去影響細胞的增殖[2]。最近的研究發(fā)現(xiàn),MAPK4在前列腺癌中過表達，干擾MAPK4的表達顯著地抑制了癌細胞的增殖和錨定依賴的增長。同時，在小鼠體內的研究也發(fā)現(xiàn)，抑制MAPK4活性能夠顯著地抑制移植瘤的生長[3]。通過研究MAPK4誘導腫瘤形成的分子機制，他們發(fā)現(xiàn)MAPK4通過激活mTOR信號通路去誘導腫瘤的發(fā)生發(fā)展。最近在骨髓瘤研究中，F(xiàn)eng等[4]發(fā)現(xiàn)MAPK4在腫瘤進展中起了重要作用，同時也發(fā)現(xiàn)，CircRNA circ_0000190通過調控miR-767-5p抑制了MAPK4的表達，從而抑制骨髓瘤的發(fā)展。

經典的MAPK家族在宮頸癌中的研究已有一些報導，然而MAPK4在宮頸癌中的作用，目前尚沒有研究報導。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4能夠激活宮頸癌細胞HeLa和SiHa中的蛋白激酶B(protein kinase B，AKT，又稱PKB)信號，進一步發(fā)現(xiàn)MAPK4的表達與宮頸癌細胞的增殖顯著相關。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMSO購買于Sigma公司，MAPK4抗體購買于Abcam公司，p-AKT-Ser473、AKT和Actin抗體購買于Cell Signalling Technology公司，siRNA合成于上海吉瑪公司，LipofectamineTM3000、CCK8檢測試劑盒、胰蛋白酶消化液購買于Thermo Scientific公司。MAPK4過表達質粒由本課題組構建。

1.2 細胞培養(yǎng)

人宮頸癌細胞系HeLa和SiHa(購于中科院上海細胞庫)，培養(yǎng)采用含10%胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基，置于37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，經檢測培養(yǎng)箱無支原體污染[5]。

1.3 細胞增殖檢測

取對數(shù)生長期細胞，用胰酶消化后稀釋成每毫升5×104個細胞的懸液接種于96孔板中，每孔200 μL(即10 000個細胞)。在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別培養(yǎng)至24、48、72及96 h，按照CCK8檢測試劑盒說明書流程在上述時間點完成細胞增殖檢測。簡單的流程如下：試驗中止前4 h加入CCK8液20 μL，再培養(yǎng)4 h，在酶聯(lián)檢測儀上檢測450 nm 波長下每孔的吸光度OD(optical density)值，按下列公式求出細胞活力。細胞活力(cell viability)=(干擾或過表達MAPK4組平均OD值/對照組平均OD值)×100%[6]。

1.4 GSCA分析細胞系mapk4基因表達

通過在線軟件GSCA(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)[7]，分析mapk4基因在已經檢測過的癌細胞系中mRNA的表達水平。根據(jù)mapk4基因的表達水平，選取了表達相對高的宮頸癌細胞HeLa和表達相對低的宮頸癌細胞SiHa。

1.5 細胞轉染

mapk4的siRNA干擾片段序列如下：5′-GGGU GAGCUGUUCAAGUUCTT-3′。對照序列(negative control,NC)：5′-UCCGUUUCGGUCCACAUUC-3′。轉染時根據(jù)LipofectamineTM3000說明書，用適量無血清培養(yǎng)液將siRNA(終濃度100 nmol/L)或MAPK4過表達質粒(6孔板中每孔加入2 μg)與LipofectamineTM3000混勻，然后加入到細胞中，8 h后換為含10%胎牛血清培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，在轉染后48 h內完成免疫印跡試驗，在轉染后96 h內完成細胞增殖檢測[8]。

1.6 免疫印跡

將處理過的細胞用胰酶消化收集，用預冷的PBS洗3遍，加入適量裂解液(50 mmol/L Tris-HCl pH 8.0、150 mmol/L NaCl、1%Triton X-100、1 mmol/L Na3VO4、100 mmol/L PMSF)在冰上裂解30 min，用移液槍反復吹打40次，避免產生氣泡。12 000 r/min離心15 min，收集上清蛋白液。采用10%～12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，然后轉移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上，轉膜完成后，用5%奶粉液或5%的牛血清白蛋白(bovine serum albumin,BSA)在室溫封閉1 h，之后分別在4 ℃孵育一抗12 h，在室溫孵育二抗1 h。ECL(electrochemiluminescence)底物顯色，A、B液以1∶1的體積比例混合，用濾紙將膜表面液體吸干，加ECL底物顯色液，放入暗盒中并壓片，5 s～5 min后顯影、定影[9]。

1.7 統(tǒng)計學分析

統(tǒng)計學方法數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，所有試驗重復3次，均為獨立試驗，計量資料采用均數(shù)±標準差表示，數(shù)據(jù)的比較分析采取student’t檢驗分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 mapk4在癌細胞系中的差異表達

為了評估m(xù)apk4在腫瘤細胞系中的表達， 通過GSCA在線軟件，在12個組織類型共65種腫瘤細胞系中，我們分析了mapk4的mRNA水平。

如圖1a所示，mapk4在肺癌細胞SCLC-21H中表達最高，其次是宮頸癌細胞HeLa。本研究選取了mapk4高表達的HeLa細胞和mapk4表達相對低的宮頸癌細胞SiHa作為研究的細胞模型。首先，通過RT-PCR試驗，我們在這兩個宮頸癌細胞中驗證了mapk4的表達，如圖1b所示，發(fā)現(xiàn)相對于HeLa細胞，SiHa細胞中mapk4的mRNA表達顯著降低。接下來，我們通過Western blot試驗，在這兩個細胞系中進一步驗證MAPK4蛋白的表達水平。如圖1c所示，與mapk4的mRNA表達結果一致，MAPK4的蛋白表達在HeLa細胞中顯著高于SiHa細胞。

圖1 mapk4在癌細胞系中的差異表達Fig.1 Expression of mapk4 mRNA in cancer cell lines(a)通過在線軟件GSCA(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/)[8]分析mapk4在已經檢測過的癌細胞系中mRNA的表達水平；(b)通過RT-PCR檢測HeLa和SiHa細胞中mapk4的mRNA水平。*** P<0.001，顯示有統(tǒng)計學顯著差異；(c)通過Western blot檢測HeLa和SiHa細胞中MAPK4的蛋白水平。Actin作為內參蛋白(a)The mapk4 mRNA levels of cancer cell lines are obtained from GSCA database(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/web/GSCALite/);(b) mapk4 mRNA levels were detected by RT-PCR in HeLa and SiHa cells. *** P<0.001 indicates significant difference;(c)MAPK4 protein levels were detected by Western blot in HeLa and SiHa cells. Actin serving as loading control

2.2 MAPK4表達影響宮頸癌細胞增殖能力

MAPK家族蛋白在促進細胞增殖過程中起了重要作用。為探索MAPK4是否與宮頸癌細胞的增殖能力相關，本研究選取了MAPK4表達相對高的HeLa細胞，通過轉染mapk4的siRNA完成了MAPK4敲低試驗，并通過CCK8(cell counting kit-8)試驗檢測了細胞的增殖能力。如圖2a所示，在轉染了mapk4的siRNA后，MAPK4的蛋白表達顯著降低。細胞活力試驗也表明，干擾MAPK4后，細胞的增殖能力顯著降低，具體見圖2b。同時，我們選取了MAPK4相對表達低的SiHa細胞，在細胞中轉染MAPK4的過表達質粒，然后通過CCK8試驗檢測了細胞的增殖能力。如圖2c所示，在轉染了MAPK4的過表達質粒后，MAPK4的蛋白表達顯著升高。細胞活力試驗也表明，高表達MAPK4蛋白后，細胞的增殖能力顯著增強(圖2d)。以上結果表明，抑制MAPK4表達能夠抑制細胞的增殖能力，而促進MAPK4蛋白表達能夠增強宮頸癌細胞的增殖能力。這些都說明在宮頸癌中MAPK4可能和腫瘤細胞的增殖能力有關。

圖2 MAPK4表達影響宮頸癌細胞增殖能力Fig.2 MAPK4 expression is associated with cell proliferation in cervical cancer cell lines(a)在HeLa細胞中轉染mapk4的siRNA 48 h后，通過Western blot檢測MAPK4的表達，Actin作為內參蛋白；(b)在HeLa細胞中轉染mapk4的siRNA 48 h后，通過CCK8試驗檢測圖中所示時間點的細胞增殖能力；(c) 在SiHa細胞中轉染MAPK4過表達質粒48 h后，通過Western blot檢測MAPK4的表達，Actin作為內參蛋白；(d)在SiHa細胞中轉染MAPK4過表達質粒48 h后，通過CCK8試驗檢測圖中所示時間點的細胞增殖能力。NC：陰性對照；Ctrl：對照。*** P<0.001，顯示有統(tǒng)計學顯著差異(a)HeLa cells were transfected MAPK4 siRNA, after 48 h, MAPK4 were detected by Western blot,Actin serving as loading control;(b) HeLa cells were transfected MAPK4 siRNA, after 48 h, cell viability was detected by CCK8 assay at the time points shown in the figure;(c)SiHa cells were transfected MAPK4-overexpressed plasmid. After 48 h, MAPK4 was detected by Western blot. Actin serving as loading control;(d)SiHa cells were transfected MAPK4-overexpressed plasmid, after 48 h, cell viability was detected by CCK8 assay at the time points shown in the figure. NC:negativecontrol;Ctrl:Control. *** P<0.001indicates significant difference

2.3 在宮頸癌細胞中MAPK4促進了AKT的活性

以上的試驗研究結果表明，MAPK4促進了細胞的增殖能力，然而其下游的分子機制尚不清楚，因此，接下來我們探索了MAPK4下游與細胞增殖可能相關的蛋白。在肺癌細胞中的研究發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT信號，因此，在本研究中我們探討了MAPK4在宮頸癌細胞中是否也能激活AKT。我們同樣地選取了MAPK4表達相對高的HeLa細胞，通過轉染mapk4的siRNA完成了MAPK4敲低試驗。接下來,通過Western blot試驗檢測了AKT的活化形式磷酸化AKT(p-AKT-Ser473)的表達。如圖3a所示，在轉染了mapk4的siRNA后，MAPK4的蛋白表達顯著降低，同時p-AKT-Ser473的表達水平也顯著降低。同時，我們選取了MAPK4表達相對低的SiHa細胞，通過轉染MAPK4的過表達質粒，檢測了p-AKT-Ser473的表達水平。如圖3b所示，在轉染了MAPK4的過表達質粒后，MAPK4的蛋白表達顯著升高，同時p-AKT-Ser473的表達水平也顯著上升。以上結果表明，抑制MAPK4表達能夠抑制AKT的活性，而促進MAPK4表達能夠增強AKT的活性。這說明在宮頸癌中MAPK4可能通過激活AKT增強了腫瘤細胞的增殖能力。

圖3 在宮頸癌細胞中MAPK4促進了AKT的活性Fig.3 MAPK4 activates AKT in cervical cancer cells(a)和 (b)在宮頸癌細胞HeLa和SiHa中，分別轉染mapk4的siRNA和MAPK4過表達質粒，48 h后通過Western blot檢測MAPK4和p-AKT-Ser473的表達。AKT作為p-AKT-Ser473的內參蛋白，Actin作為總的內參蛋白(a) and (b) HeLa and SiHa cells were transfected mapk4 siRNA and MAPK4-overexpressed plasmid respectively, after 48 h, MAPK4 and p-AKT were detected by Western blot. AKT serving as loading control for p-AKT, Actin serving as loading control for total protein

3 討論

在全世界宮頸癌是女性第三常見的癌癥[10]。隨著篩選方法的不斷改進以及發(fā)達國家的疫苗接種計劃，發(fā)達國家與資源匱乏的發(fā)展中國家的婦女在宮頸癌發(fā)病率方面差異越來越顯著[11]。目前，大于85%的宮頸癌死亡發(fā)生在中低收入人群的國家。已知宮頸癌的發(fā)生與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus,HPV)感染顯著相關，然而在沒有感染HPV的人群中也有一部分人會發(fā)展為宮頸癌[12]，這可能和遺傳以及病毒之外的環(huán)境因素有關。現(xiàn)已有研究表明，一些原癌基因的突變能夠引起宮頸癌的發(fā)生，因而靶向抑制這些癌基因對宮頸癌的治療有潛在的價值[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4促進了宮頸癌細胞的增殖，因而MAPK4可以作為宮頸癌治療的潛在靶點。但本研究我們僅用到了2個宮頸癌細胞系驗證MAPK4促進宮頸癌細胞增殖，缺乏動物試驗的結果。因此，下一步需要構建動物模型，在體內驗證MAPK4促進了宮頸癌的增殖，同時，也需要在臨床組織標本中檢測MAPK4的表達是否與病人的預后相關。

在大多數(shù)人類腫瘤中，AKT蛋白是最常見的、活化的癌基因產物。AKT活化的主要機制包括2個主要途徑：一是通過腫瘤抑制基因pten突變，從而使PTEN失活，PTEN是AKT的一個抑制蛋白，因此PTEN突變的失活會導致AKT的過度激活；二是PI3K酶活性亞基的活化突變，pi3k是AKT蛋白的直接上游基因，PI3K能夠直接磷酸化激活AKT，因此PI3K的突變激活能夠促進AKT的過度激活[14,15]。最近越來越多的證據(jù)表明，除了上述兩條途徑外還有一些蛋白的表達和活性失調也影響了AKT的活性。比如ras基因突變導致Ras蛋白的過度活化也直接影響了AKT的活性，另外，akt基因自身的突變也是導致其過度活化的原因，如發(fā)生在AKT蛋白的pH功能區(qū)E17位的突變[16]。akt基因的擴增導致AKT蛋白的過度表達也是AKT過度活化的原因之一。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)MAPK4過表達能夠激活AKT的活性，然而具體的分子機制仍然不清楚。MAPK4是否直接與AKT相互作用，從而磷酸化AKT？還是通過激活一個中間分子間接激活AKT？這其中的分子機制還有待進一步研究。最近在肺癌的研究報道中發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT的活性，然而關于MAPK如何激活AKT活性的具體機制并未闡明。AKT促進細胞的增殖主要涉及以下幾種機制：1)抑制細胞周期抑制蛋白p27表達，p27蛋白能夠與細胞周期相關蛋白激酶(cyclin-dependent kinases,CDK)結合，從而抑制CDK的活性，進而阻止細胞周期的進展[17]；2)促進細胞糖代謝，為細胞分裂增殖提供營養(yǎng)[18]；3)抑制GSK3β的活性，GSK3β能夠促進細胞周期蛋白cyclinD1的降解，從而使細胞周期從G1向S期轉化受到阻止，而AKT能夠抑制GSK3β的活性，因此促進了cyclinD1的表達，從而加速細胞周期從G1向S期轉化[19]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)MAPK4激活了AKT，然而并沒有檢測AKT下游促進細胞增殖的信號。因此，在接下來的研究中，需要進一步檢測AKT下游的信號是否受MAPK4的影響。

總之，本研究發(fā)現(xiàn)MAPK4促進宮頸癌細胞的增殖，這表明在宮頸癌中靶向抑制MAPK4能夠抑制宮頸癌的進展，MAPK4可以作為宮頸癌治療的潛在靶點。