芪藶強(qiáng)心膠囊對慢性心力衰竭大鼠心肌巨噬細(xì)胞衍生趨化因子表達(dá)的影響

劉春紅， 姜德友， 陳飛， 解穎， 王金賀， 王偉明， 孫許濤

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江哈爾濱 150040；2.黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150040）

慢性心力衰竭（CHF）是多種病因引起的心肌收縮/舒張功能障礙，是諸多心血管疾病發(fā)展到終末期的共同轉(zhuǎn)歸即終點(diǎn)站，曾被世界心臟病學(xué)家Braunwald教授[1]比喻為“心臟病最后的戰(zhàn)斗場”。CHF在世界各地的發(fā)病率越來越高，并且隨著年齡的增加患病率亦明顯上升，已成為當(dāng)今影響人們健康的最主要心血管系統(tǒng)疾病之一[2-3]。目前，西藥在治療CHF方面雖然已取得良好的效果，但CHF的預(yù)后仍然較差，如β受體阻滯劑、血管緊張素轉(zhuǎn)換酶抑制劑（ACEI）等盡管能夠很好地抑制心室重塑[4-5]，可對于腎功能不全、藥物禁忌癥或難以耐受藥物的患者來說，其治療仍有較大的局限性。故CHF的預(yù)防與治療仍是國內(nèi)外眾多學(xué)者主要研究的問題。芪藶強(qiáng)心膠囊作為近年來中醫(yī)藥防治心血管疾病的重要發(fā)現(xiàn)之一，其在臨床上已顯示出很好的療效[6-7]。研究表明，芪藶強(qiáng)心膠囊可有效緩解CHF的各種臨床癥狀，具有利尿、強(qiáng)心、擴(kuò)張血管，抑制腎素—血管緊張素—醛固酮系統(tǒng)（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）的系統(tǒng)激活、心室重構(gòu)，改善心功能，延緩CHF病程等作用[8-9]。課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)，“巨噬細(xì)胞衍生趨化因子（MDC）→趨化因子受體4（CCR4）→G蛋白”通路在CHF的發(fā)生發(fā)展及治療過程中起到重要作用[10]。因此，為進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥，本研究觀察了芪藶強(qiáng)心膠囊對CHF大鼠心肌組織MDC表達(dá)的影響，探討其對改善CHF大鼠心功能的作用機(jī)制，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1動物60只清潔級健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量（245±5）g，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供，動物質(zhì)量合格證號：SCXK（遼）2015-0001。飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細(xì)胞分子生物實驗室，溫度（25±1）℃，相對濕度（50±5）%，通風(fēng)及光照良好，環(huán)境適宜。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2藥物、試劑與儀器芪藶強(qiáng)心膠囊（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號：A1511014）；地高辛片（上海信誼藥廠有限公司，批號：020150808）；阿霉素（adriamycin）（山西普德藥業(yè)有限公司，批號：020150703）。大鼠MDC酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）96 Tests試劑盒、PV-6001 PowerVisionTMTwo Step免疫組織化學(xué)試劑盒（北京博奧拓達(dá)科技有限公司）。顯微攝影成像系統(tǒng)（美國Thermo公司）；UC-7超波切片機(jī)（德國Leica公司）；病理圖像分析系統(tǒng)（美國Thermo公司）；JEM-1400PLUS透射電子顯微鏡（日本電子株式會社）；Vivid7彩色超聲診斷儀（美國GE公司）。

1.3分組、造模與給藥從60只大鼠中隨機(jī)選取15只作為空白組，其余45只制備CHF模型[11]。方法：用生理鹽水配制成2 mg/mL的阿霉素溶液，按1.5 mg/kg的劑量進(jìn)行腹腔注射，每周2次，共注射7周，建立CHF大鼠模型。空白組同期注射等體積生理鹽水。將45只成模大鼠隨機(jī)分為3組，即芪藶強(qiáng)心治療組、地高辛對照組和模型組，分別對應(yīng)給予芪藶強(qiáng)心膠囊溶液（劑量為0.09 g/kg，0.09 g即膠囊內(nèi)容物質(zhì)量）、地高辛混懸液（劑量為0.019 mg/kg），生理鹽水（3 mL/只）灌胃，每天3 次[10]，共灌胃28 d。

1.4大鼠超聲心動圖觀察所有大鼠末次灌胃禁食12 h后，腹腔注射30 g/L戊巴比妥鈉溶液（0.2 mL/kg）進(jìn)行麻醉。成功麻醉之后，將大鼠仰臥固定于操作臺。用剃毛器除去大鼠胸前毛發(fā)，充分暴露胸部。采用10 s探頭的Vivid7彩色超聲儀，探頭頻率為7～12 mHz。將涂抹耦合劑的探頭置于大鼠胸骨左緣，對大鼠進(jìn)行心臟超聲掃查。分別測量左心室舒張末期內(nèi)徑（LVIDd）、左心室收縮末期內(nèi)徑（LVIDs）、左心室短軸縮短率（FS）、射血分?jǐn)?shù)（EF）等指標(biāo)，測量3次，取其平均值。

1.5大鼠心臟血流動力學(xué)指標(biāo)檢測大鼠心臟彩色超聲檢查后，用玻璃針慢慢將大鼠右側(cè)頸總動脈剝離，徹底暴露動脈后用手術(shù)線將遠(yuǎn)心端頸動脈結(jié)扎；再向近心端方向插管，經(jīng)壓力轉(zhuǎn)換器連接BL-420S生物機(jī)能實驗系統(tǒng)，分別檢測左心室收縮/舒張末期壓力（LVSP/LVEDP）、左心室內(nèi)壓最大變化速率（±dp/dtmax）等指標(biāo)。

1.6標(biāo)本的采集及保存上述實驗完成后，沿正中線切開胸壁，暴露出心臟后迅速摘取心臟，用冰鹽水沖洗干凈，去除多余水分后切取適量左心室組織，用電鏡液保存，其余部分置于液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)觀察

1.7.1 蘇木素—伊紅（HE）染色 將左心室組織放入體積分?jǐn)?shù)4%甲醛溶液中固定，常規(guī)脫水后石蠟包埋，連續(xù)切片厚度約4μm，HE染色，觀察心肌形態(tài)結(jié)構(gòu)變化。

1.7.2 透射電鏡 取心肌組織用體積分?jǐn)?shù)2.5%戊二醛溶液（pH=7.0）固定，磷酸鹽緩沖液漂洗6次，10 g/L鋨酸固定后梯度脫水，包埋、固化、切片，醋酸雙氧鈾、檸檬酸鉛進(jìn)行雙重染色。應(yīng)用透射電鏡觀察，攝片。

1.8大鼠心肌組織MDC表達(dá)和含量測定

1.8.1 免疫組織化學(xué)法 按照PV-6001PowerVisionTMTwo Step試劑盒說明進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。顯微鏡下每張切片隨機(jī)挑選6個視野，用Image-pro plus 5.0圖像分析系統(tǒng)測定MDC陽性積分光密度（IOD），取其平均值表示MDC表達(dá)水平。

1.8.2 ELISA法 心肌組織加入適量緩沖液進(jìn)行研磨離心，取上清，按照MDCELISA 96 Tests試劑盒方法對濃度已均衡的左室心肌組織MDC含量進(jìn)行檢測。

1.9統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗，多組比較采用單因素方差分析。進(jìn)一步兩兩比較，若方差齊，采用Bonferroni檢驗，若方差不齊，采用Dunnett T3檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠超聲心動圖觀察指標(biāo)比較圖1結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠超聲心動圖參數(shù)LVIDd、LVIDs明顯升高，EF、FS明顯降低，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強(qiáng)心治療組、地高辛對照組超聲心動圖參數(shù)LVIDd、LVIDs下降，EF、FS上升，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；芪藶強(qiáng)心治療組LVIDd、LVIDs、EF、FS與地高辛組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組大鼠超聲心動圖觀察指標(biāo)比較（±s）Figure 1 Comparison of the indexes observed by analysis of ultrasonic cardiogram in rats of various groups（-x ± s）

2.2各組大鼠心臟血流動力學(xué)變化比較圖2結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組大鼠LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯降低，LVEDP明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強(qiáng)心治療組LVEDP明顯下降，LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax明顯升高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；芪藶強(qiáng)心治療組LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax、LVEDP與地高辛對照組比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 各組大鼠心臟血流動力學(xué)指標(biāo)比較（±s）Figure 2 Comparison of the cardiac haemodynamics indexes in rats of various groups（± s）

2.3各組大鼠心肌組織病理形態(tài)學(xué)變化比較

2.3.1 HE染色結(jié)果 圖3結(jié)果顯示：空白組心肌細(xì)胞排列整齊，胞核染色無固縮，胞質(zhì)染色無腫脹，間質(zhì)無擴(kuò)張充血和炎細(xì)胞浸潤；模型組大鼠心肌纖維組織排列明顯紊亂，部分心肌胞核固縮深染，胞漿腫脹斷裂濃染，間質(zhì)增生充血并可見炎癥細(xì)胞浸潤；芪藶強(qiáng)心治療組和地高辛對照組大鼠心肌組織病理形態(tài)較模型組均有不同程度改善，心肌纖維排列相對規(guī)整，胞核固縮數(shù)目明顯減少，胞質(zhì)腫脹明顯減輕，間質(zhì)無明顯增生，無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。

2.3.2 透射電鏡結(jié)果 圖4結(jié)果顯示：空白組心肌組織正常；模型組心肌組織內(nèi)肌原纖維走形紊亂，肌節(jié)斷裂，長短不一，肌絲灶性溶解、消失。核膜斷裂，核固縮，肌漿網(wǎng)囊性擴(kuò)張，核內(nèi)可見空泡樣變，壞死的心肌細(xì)胞附近出現(xiàn)成束的膠原纖維增生；芪藶強(qiáng)心治療組和地高辛對照組大鼠心肌較模型組大有改善，肌原纖維排列相對整齊，肌節(jié)發(fā)育較好，肌絲結(jié)構(gòu)尚可，心肌組織間質(zhì)及核周圍結(jié)構(gòu)基本正常，無水腫。

圖3 各組大鼠心肌組織HE染色結(jié)果比較（×400）Figure 3 Comparison of HE staining results of myocardial tissue in rats of various groups（× 400）

2.4各組大鼠心肌組織MDC含量和表達(dá)比較圖5～7結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組MDC含量和表達(dá)顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強(qiáng)心治療組與地高辛對照組MDC含量和表達(dá)顯著增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；芪藶強(qiáng)心治療組MDC含量和表達(dá)與地高辛對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖4 各組大鼠心肌組織透射電鏡結(jié)果比較（×5 000）Figure 4 Comparison of transmission electronmicroscopical results of myocardial tissue in rats of various groups（× 5 000）

圖5 各組大鼠心肌組織MDC含量比較（ELISA法，±s）Figure 5 Comparison of MDC content in rat myocardial tissue in various groups（by ELISA， -x±s）

3 討論

本研究結(jié)合超聲心動圖、心臟血流動力學(xué)各項指標(biāo)及光學(xué)顯微鏡結(jié)果，證明慢性心力衰竭（CHF）大鼠模型復(fù)制成功。而芪藶強(qiáng)心膠囊對CHF大鼠心臟超聲心動圖及心臟血流動力學(xué)中各項指標(biāo)有明顯的改善作用，但恢復(fù)程度不及空白組，表明芪藶強(qiáng)心膠囊可有效改善CHF大鼠心功能，但阿霉素致心臟損傷已不可逆。

圖6 各組大鼠心肌組織MDC陽性細(xì)胞分布比較（免疫組織化學(xué)法，×400）Figure 6 Comparison of the MDC-positive cell distribution in rat myocardial tissue in various groups（by immunohistochemistry，× 400）

圖7 各組大鼠心肌組織MDC表達(dá)比較（免疫組織化學(xué)法，±s）Figure 7 Comparison of MDC expression in rat myocardial tissue in various groups（by immunohistochemistry，±s）

趨化因子是一類對白細(xì)胞有化學(xué)趨化作用的細(xì)胞因子，具有促細(xì)胞骨架重新排列引起細(xì)胞形態(tài)改變，促肌動蛋白板層足形成和退縮，升高活化白細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度以及促進(jìn)胞內(nèi)顆粒內(nèi)容物的釋放等功能[12]。趨化因子主要分為4個亞家族，即CL、CCL、CXCL及CX3CL，目前已發(fā)現(xiàn)50余種。其中MDC，又稱為CCL22，是CCL類趨化因子之一，其與胸腺活化調(diào)節(jié)因子（TARC）的基因編碼位點(diǎn)相同，二者有32%相似的基因序列，并且都能夠識別CC趨化因子受體4（CCR4）[13]。有研究表明，CCR4是G蛋白偶聯(lián)受體，是公認(rèn)的MDC受體。CHF發(fā)病過程中，由于抑制性G蛋白（Gi）增加、激動性G蛋白（Gs）降低、β1受體下調(diào)，從而導(dǎo)致Gs與β腎上腺素受體耦聯(lián)障礙；另外，細(xì)胞內(nèi)cAMP含量下降，導(dǎo)致肌漿網(wǎng)（SR）對Ca2+的攝取和釋放障礙，最終影響心肌的舒縮功能。當(dāng)MDC與CCR4受體特異性結(jié)合后，一方面激活G蛋白，使Ca2+活化，促進(jìn)Ca2+細(xì)胞內(nèi)流，增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度而加強(qiáng)心肌收縮功能，另一方面又可以誘導(dǎo)磷酸接納蛋白的磷酸化，從而促進(jìn)肌漿網(wǎng)對Ca2+的攝取而改善心肌的舒張[14-19]。本課題組前期通過對CHF大鼠靶基因預(yù)測研究發(fā)現(xiàn)，MDC-CCR4相關(guān)的生物學(xué)通路達(dá)15種，其中包括“MDC→CCR4→G蛋白”通路[20]。而在本研究中結(jié)果顯示：與空白組比較，模型組MDC含量和表達(dá)水平下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，芪藶強(qiáng)心治療組和地高辛對照組MDC含量和表達(dá)顯著增高（P＜0.05），且2個治療組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），提示芪藶強(qiáng)心膠囊可有效改善大鼠CHF，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)MDC蛋白含量和表達(dá)進(jìn)而提高心功能有關(guān)。

綜上所述，芪藶強(qiáng)心膠囊可能通過調(diào)節(jié)心肌MDC含量和表達(dá)而改善心肌舒縮功能，對CHF大鼠心臟起保護(hù)作用。