黃芪桂枝五物湯加味對變應性鼻炎大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫失衡的調節作用

陳俊曦， 黃東輝， 左曉暉， 陳舒， 冼小燕

（佛山市中醫院，廣東佛山 528000）

變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是個體接觸過敏原后，由免疫球蛋白E（IgE）介導的多種免疫細胞和炎癥因子參與的鼻黏膜非感染性疾病，屬于I型變態反應性疾病[1]。AR主要表現為反復發作噴嚏、流涕和鼻塞，嚴重影響患者的生活和工作。據調查，目前全世界約有5億AR患者，患病率為10%～25%，我國患病率為18%[2]。目前，現代醫學治療AR主要以激素和抗組胺藥物治療為主，但副作用較明顯，且效果不甚理想。輔助性T（Thellper，Th）細胞Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫失衡、嗜酸粒細胞（EOS）等在AR的發生發展中起到重要的作用[3]。AR歸屬中醫學“鼻鼽”范疇，其病機主要為肺脾虛寒。黃芪桂枝五物湯具有益氣溫經作用，本課題組在臨床實踐中發現黃芪桂枝五物湯治療AR具有良好的療效，亦與多個研究報道結果一致[4-6]，但其機制尚不明確。因此，本研究觀察黃芪桂枝五物湯加味對AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫失衡的影響，探討其可能的作用機制，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級健康Wistar雌性大鼠60只，6～7周齡，體質量180～200 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，動物質量合格證號：SCXK（粵）2018-0002。飼養于佛山市中醫院中醫藥研究所，飼養環境：溫度（23±2）℃，濕度（50±5）%。

1.2藥物及制備黃芪桂枝五物湯加味方藥組成：黃芪20 g，桂枝15 g，芍藥15 g，大棗10 g，生姜10 g，辛夷15 g，五味子5 g。上述中藥飲片均由廣州致信藥業有限公司提供。每付中藥飲片加8倍量的水分別煎煮1.5 h和1 h，將2次藥液混合濃縮至2 g/mL，4℃保存。氯雷他定片（由西安楊森制藥有限公司生產，批號：20171123），加生理鹽水配制成濃度為2 g/L的藥液。

1.3試劑與儀器卵白蛋白（上海聯邁生物工程有限公司，批號：2017120354）；氫氧化鋁（上海源葉生物科技有限公司，批號：2018023417）；黏蛋白5AC（MUC5AC）、黏蛋白5B（MUC5B）、IgE、組胺、白三烯酶聯免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）；干擾素γ（IFN-γ）ELISA試劑盒（美國ScienCell公司）；白細胞介素（IL）-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10 ELISA試劑盒（德國PromoCell公司）。Multiskan Sky酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.4動物分組與模型構建將60只大鼠隨機分為正常組（15只）和造模組（45只）。將造模組大鼠構建AR模型，參照周柳青等[4]方法：①基礎致敏：卵白蛋白300 mg+氫氧化鋁30 mg+生理鹽水1 mL腹腔注射，隔日1次，共8次；②攻擊致敏：基礎致敏階段末次腹腔注射結束后，隔日開始鼻內激發階段。即2%卵白蛋白溶液滴入雙側鼻腔，每側0.05 mL，1次/d，共7次。正常組大鼠基礎致敏期間給予等體積的氫氧化鋁30 mg+生理鹽水1 mL腹腔注射，攻擊致敏期間給予生理鹽水雙側滴鼻。末次滴鼻30 min后觀察大鼠抓鼻、噴嚏、流涕癥狀，進行鼻部癥狀評分，若總分＞5分，則判斷AR模型建立成功[7]。造模組有39只大鼠符合AR模型標準，然后將其隨機分為模型組（12只）、中藥組（14只）和氯雷他定組（13只）。

1.5給藥方法按照徐淑云主編的《藥理實驗方法學》中人鼠藥物劑量換算公式[8]計算給藥劑量。造模結束后，中藥組給予黃芪桂枝五物湯加味10 g·kg-1·d-1灌胃，氯雷他定組給予氯雷他定生理鹽水溶液1.05 mg·kg-1·d-1灌胃，正常組和模型組給予等體積的生理鹽水灌胃，1次/d，共28 d。

1.6鼻炎癥狀評分[7]觀察大鼠抓鼻、噴嚏、流涕癥狀。抓鼻（30 min次數）：1分（0～5次）、2分（6～9次）、3分（＞9次）；噴嚏（次/30 min）：1分（1～3次）、2分（4～9次）、3分（＞9次）；流涕：1分（流涕至鼻孔內）、2分（流涕出鼻孔外）、3分（流涕滿面）。

1.7采用ELISA法檢測大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯、IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平所有大鼠末次灌胃結束后，禁食不禁水16 h，以100 g/L水合氯醛腹腔注射處死，輔助動脈采血20 mL，以3 000 r/min離心15 min，取上清液，-70℃保存。血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯ELISA檢測方法的具體操作步驟按照各指標試劑盒說明書進行：將標準品和待測血清50μL分別加入反應孔內，然后加入50μL的標記抗體，37℃溫育1 h。洗滌液清洗3次。每孔加入80μL的親和鏈酶素-HRP，37℃溫育30 min。洗滌液清洗3次。每孔加入底物A、B各50μL，37℃溫育10 min，加入50μL終止液后，應用酶標儀在450 nm波長處測定各孔的光密度（OD）值。

1.8統計方法采用SPSS21.0統計軟件進行數據分析，實驗數據均以均值±標準差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1各組大鼠鼻部癥狀評分的比較表1結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠鼻部癥狀評分明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠鼻部癥狀評分明顯降低（P＜0.05），且2個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可以改善AR大鼠的鼻炎癥狀。

表1 各組變應性鼻炎大鼠鼻部癥狀評分的比較Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

表1 各組變應性鼻炎大鼠鼻部癥狀評分的比較Table 1 Comparison of the scores of rhinitis symptoms in various groups （±s，s/分）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組鼻部癥狀評分0.42±0.02 6.54±1.04①1.34±0.24②1.15±0.16②N/只15 12 14 13

2.2各組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較表2結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平明顯升高（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平明顯降低（均P＜0.05），且2個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可降低AR大鼠引起噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀的物質含量，從而減輕鼻炎癥狀。

表2 各組變應性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

表2 各組變應性鼻炎大鼠血清MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平的比較Table 2 Comparison of the levels of serum MUC5AC，MUC5B，IgE，histamine and leukotrienes in various groups （±s）

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組白三烯[ρ/（ng·L-1）]32.34±9.57 56.27±9.56①39.21±8.32②36.12±7.24②N/只15 12 14 13 MUC5AC[ρ/（pg·mL-1）]26.35±3.24 56.87±7.13①32.16±6.32②29.84±4.28②MUC5B[ρ/（pg·mL-1）]31.27±5.43 67.28±8.73①36.54±6.57②39.72±5.46②IgE[ρ/（pg·mL-1）]21.36±6.57 43.21±9.25①24.69±5.17②26.21±4.68②組胺[ρ/（μg·L-1）]11.38±1.27 24.38±3.64①12.17±1.65②11.62±1.53②

2.3各組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較表3結果顯示：與正常組比較，模型組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明顯升高，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯降低（均P＜0.05）；與模型組比較，中藥組和氯雷他定組大鼠血清IL-4、IL-5、IL-17水平明顯降低，IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯升高（均P＜0.05），且2個治療組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。表明黃芪桂枝五物湯加味可調節AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫平衡，抑制炎癥反應，從而起到發揮治療AR的作用。

3 討論

有研究表明，Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫失衡是變應性鼻炎（AR）發生的2種重要機制[9]。Th1/Th2和Th17/Treg細胞及其分泌的細胞因子在AR的發生發展中具有重要的意義。機體接觸變應原后，經抗原呈遞細胞傳遞給Th細胞并分化為Th2細胞，Th2細胞誘導B細胞分泌IgE，聚集在鼻黏膜。當變應原再次進入機體內時，與IgE結合，引起肥大細胞釋放組胺、白三烯等物質，促進EOS浸潤，釋放高毒性陽離子蛋白，導致鼻黏膜上皮細胞損傷，引起毛細血管擴張，同時促進鼻黏膜腺體分泌MUC5AC、MUC5B黏液分泌過多，引起噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀[10]。因此，MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯是導致AR大鼠出現噴嚏、流涕、鼻塞等癥狀的直接物質基礎。IFN-γ和IL-2由Th1細胞分泌。IFN-γ可以抑制Th2細胞分泌IL-4和抑制IgE合成，是IgE強抑制因子[11]；IL-2可促進NK細胞增殖活化，抑制B細胞合成IgE[11]。IL-5和IL-4由Th2細胞分泌。IL-5可活化并促進EOS浸潤和釋放毒性蛋白，引起鼻黏膜腺體分泌、通透性增加[12]；IL-4可以活化B細胞，促進IgE的合成，同時可以促進EOS浸潤[13]。IL-17由Th17細胞分泌，可促進多種炎癥因子和趨化因子的合成，有較強的促炎作用[14]。IL-10由Treg細胞分泌，可抑制炎癥因子合成和抑制嗜酸性粒細胞、肥大細胞釋放組胺、白三烯等物質，減輕炎癥反應[15]。因此，調節Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫平衡是治療AR的重要途徑。

表3 各組變應性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

表3 各組變應性鼻炎大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-5、IL-17、IL-10水平的比較Table 3 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-2，IL-4，IL-5，IL-17 and IL-10 in various groups[±s，ρ/（ng·mL-1）]

①P＜0.05，與正常組比較；②P＜0.05，與模型組比較

組別正常組模型組中藥組氯雷他定組IL-10 16.87±1.98 6.37±1.02①13.92±1.63②14.67±1.34②N/只15 12 14 13 IFN-γ 67.35±8.67 41.25±6.15①56.32±7.25②57.96±9.14②IL-2 6.87±1.03 3.06±0.69①6.15±1.13②6.62±1.24②IL-4 8.57±1.24 26.83±6.12①10.34±2.37②9.36±1.86②IL-5 2.63±0.15 4.67±0.39①2.78±0.41②2.86±0.34②IL-17 16.21±2.18 35.21±5.72①20.31±5.18②18.32±3.19②

AR屬于中醫學“鼻鼽”范疇，病位在脾、肺二臟，肺脾虛損，肺氣虛寒，衛表不固，腠理疏松，脾氣虛寒，化生不足，鼻竅失養，風寒乘虛而入，邪聚鼻竅，發為鼻鼽[16-17]。鼻鼽總屬于本虛標實之病，虛在脾肺虛寒，實在風寒之邪。本研究所用的中藥方是在黃芪桂枝五物湯原方基礎上加辛夷、五味子而成，方中：黃芪補脾益肺，補在表之氣；桂枝溫陽散寒；芍藥養血和營，調和營衛；大棗養血益氣，助黃芪之功；生姜疏散風寒；辛夷疏風散寒，通塞利竅；五味子斂肺，防溫藥辛散太過。諸藥合用，共奏益氣溫陽、宣通鼻竅之功。本研究采用卵白蛋白誘導大鼠AR模型，結果顯示與正常組比較，模型組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯降低（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平和鼻炎癥狀評分明顯升高（P＜0.05），提示成功建立大鼠AR模型，且AR大鼠存在Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫失衡。究其病機，AR細胞免疫失衡與中醫正虛邪實具有高度相關性。介導保護性免疫的Th1和Treg細胞可以抑制炎癥反應，加強免疫功能，而促炎的Th2和Th17細胞可以加重炎癥，引發AR。因此，當體外環境因素作用于機體導致異常免疫反應，導致Th1和Treg細胞活性減弱，IFN-γ、IL-2、IL-10分泌減少（相當于“正虛”），Th2和Th17細胞分化增多，IL-4、IL-5、IL-17分泌增加，造成MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯等病理產物聚集鼻竅（相當于“邪實”），發為鼻鼽。經干預后，與模型組比較，中藥組大鼠血清IFN-γ、IL-2、IL-10水平明顯升高（P＜0.05），血清IL-4、IL-5、IL-17、MUC5AC、MUC5B、IgE、組胺、白三烯水平和鼻炎癥狀評分明顯降低（P＜0.05）。提示黃芪桂枝五物湯加味可調節AR大鼠Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫平衡，抑制炎性分子正常產生，降低炎性反應程度，得以“扶正祛邪”，從而改善AR的癥狀。

綜上所述，黃芪桂枝五物湯加味可改善AR大鼠鼻炎癥狀，其機制可能與調節Th1/Th2和Th17/Treg細胞免疫平衡有關。