基于網絡藥理學預測歸腎丸治療卵巢早衰的作用機制

閆菲， 史云， 趙琦， 王曉梅， 蘇先芝， 劉一斐， 韓福國， 劉清飛

（1.北京中醫藥大學，北京 100029；2.北京中醫藥大學東直門醫院，北京 100700；3.清華大學藥學院，北京 100084）

卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）是指女性在40歲之前出現卵巢功能減弱甚至衰竭，以血清促卵泡生成素（follicle stimulating hormone，FSH）與黃體生成素（luteinizing hormone，LH）濃度升高和雌二醇（estradiol-2，E2）濃度下降為特征的衰老性疾病[1]。近年來由于社會壓力增加、飲食生活習慣改變、環境污染等因素使得卵巢早衰的發病率逐漸升高并呈現年輕化趨勢，據統計，其年發病率在1%～3%之間[2]。目前早發性卵巢功能不全臨床診療指南推薦卵巢早衰治療主要包括激素替代療法（hormone replacement therapy，HRT）、免疫抑制劑、卵巢凍存和移植、基因治療、干細胞移植、脫氫表雄酮（DHEA）等[3]。HRT可以維持年輕患者的第二性征，恢復月經樣出血，但會增加高危人群卵巢癌、乳腺癌風險[4]。促排卵可輔助生育，但易并發卵巢過度刺激，加速卵巢功能衰竭[5]。而干細胞治療、靶向基因治療、卵巢凍存和移植技術復雜，副作用暫不明確，多數尚處在評估安全性的動物實驗階段[6-9]。因此，在臨床中找到更有效治療卵巢早衰疾病的方法，延緩卵巢衰老病程是婦科學領域的重要研究問題。

中醫學無卵巢早衰病名，多將其歸屬“閉經”“月經量少”“年未老經水斷”等范疇，腎虛是卵巢早衰發病的重要病因，肝郁脾虛、血瘀是次要病因病機。歸腎丸是《景岳全書》中的經典方劑，由熟地黃、山茱萸、杜仲、當歸、菟絲子、枸杞子、山藥、茯苓等8味中藥組成，藥味配伍精干練達，具有補陰益陽、養血填精的功效[10]。多項臨床研究證明歸腎丸能有效改善卵巢早衰患者潮熱、盜汗、月經量少等癥狀[11-12]；相關動物實驗表明，歸腎丸能顯著改善卵巢早衰模型大鼠卵泡功能[13-15]，對卵巢顆粒細胞也具有調整內分泌、抑制凋亡等作用[16-17]。目前，歸腎丸治療卵巢早衰的主要活性成分及作用機制未見系統闡釋。網絡藥理學（network pharmacology）是近年來發展起來的新興學科，它將中藥藥理學、高通量生物信息學、高端數據分析軟件高度整合，提出了“藥物—靶標—病證”的中醫藥網絡藥理學研究新理念，為中藥藥效物質基礎、療效機理研究奠定了科學基礎[18]。因此，本研究采用網絡藥理學方法對歸腎丸治療卵巢早衰的主要成分、關鍵靶點和信號通路進行挖掘，以期解釋其潛在的作用機制而為下一步研究指明方向，現將研究結果報道如下。

1 資料與方法

1.1歸腎丸活性成分與潛在靶點篩選采用中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）、中藥分子機制的生物信息學分析工具（BATMAN-TCM）、中藥分子機制綜合數據庫（TCMID）檢索歸腎丸中各味藥材的全部化學成分，并以口服生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0.18作為活性化合物的篩選條件，將3個數據庫的成分預測靶點合并，建立歸腎丸化學成分—靶點數據集。

1.2卵巢早衰疾病靶點篩選通過在線人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//www.omim.org/）、人類基因數據庫（GeneCards，https：//www.genecards.org），以“premature ovarian failure”為關鍵詞檢索卵巢早衰的相關靶點，建立卵巢早衰疾病靶點數據集。將成分靶點數據集和疾病靶點數據集取交集，獲得歸腎丸—卵巢早衰疾病的共同靶點，并進行藥物成分靶點—卵巢早衰疾病靶點映射，利用Cytoscape 3.6.1軟件構建“活性成分—作用靶點”網絡，藥物活性成分和作用靶點以“節點”表示，節點之間的相互作用以“邊”表示。

1.3蛋白質—蛋白質相互作用（PPI）網絡的構建將歸腎丸—卵巢早衰共同作用靶點導入STRING（https：//string—db.org/）數據庫中，以置信度分數score≥0.700（高置信度）為條件進行篩選，并隱藏網絡中無聯系的節點，余參數不變，將得到的結果以文本形式導入CytoScape 3.6.1軟件中進行可視化，獲得蛋白質相互作用網絡。

1.4基因本體論（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析利用David 6.8數據庫（https：//david.ncifcrf.gov/）對歸腎丸和卵巢早衰疾病共同作用靶點蛋白進行GO生物功能和KEGG信號通路富集分析。GO生物功能分析主要用于描述基因靶點的功能，包括細胞功能、分子功能和生物功能3部分。KEGG富集分析可以得到歸腎丸和卵巢早衰疾病共同靶點所富集的信號通路。GO和KEGG分析均以P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1歸腎丸活性成分與潛在靶點篩選通過在TCMSP、BATMAN-TCM、TCMID平臺檢索，并將3個數據庫篩選結果合并，共獲得歸腎丸活性成分162個，其中熟地黃2個，山藥18個，山茱萸23個，茯苓16個，當歸6個，杜仲42個，枸杞子43個，菟絲子12個，共預測潛在靶點829個。

2.2卵巢早衰疾病靶點篩選在OMIM、Gene Cards數據庫檢索，并結合相關文獻共得到與卵巢早衰疾病相關的靶點4 854個。將藥物靶點和疾病靶點取交集，共得到AKT1、CASP3、CASP8、CASP9、FAS、EGF等152個共同靶點。

2.3“成分—靶點—疾病”網絡構建將歸腎丸活性成分與卵巢早衰關鍵靶基因及相關對應關系以及屬性導入到CytoScape，建立“成分—靶點—疾病”網絡，見圖1。使用CentiScape計算活性成分中心性（Degree Centrality，DC）。一個節點DC越大，說明節點在網絡中越重要。DC結果槲皮素（quercetin）為88，豆甾醇（stigmasterol）為36，山萘酚（kaempferol）為33，β-胡蘿卜素（beta-carotene）為15，表兒茶素（ent-epicatechin）為14，分別位于前5位，見表1。

2.4 PPI網絡的構建將152個共同靶點導入STRING中，選擇高置信度0.700，下載PPI.tsv文件導入到CytoScape，得到151個PPI網絡基因。其中TP53、AKT1、MMP9、ASP3、IL6位于核心基因位置。結果如圖2、3。

圖1歸腎丸治療卵巢早衰“化合物—靶點”圖Figure 1 “Component-target”network of Guishen Pills in treating POF

表1 歸腎丸活性成分以及OB、DL（DC數前10位）Table 1 Information of active ingredients in Guishen Pills and their OB，DL（top 10 DC）

圖2 歸腎丸治療卵巢早衰潛在靶標相互作用網絡Figure 2 The interaction network of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖3 歸腎丸治療卵巢早衰前10位潛在靶標的互作網絡圖Figure 3 The interaction network of top10 candidate targets from Guishen Pills in treating POF

2.5歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物學過程根據顯著性程度P值由小到大進行展示，GO分析結果提示歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物過程（BP）顯著富集含氧化合物反應、細胞對化學刺激的反應、化學反應、對有機物的反應、對有機循環化合物的反應；在分子功能（MF）主要富集在酶結合、信號受體結合、分子功能監管、相同蛋白結合、激酶結合上；細胞組分（CC）主要富集在細胞外空間、細胞外區域、膜筏、膜區域上。見圖4～6。

2.6歸腎丸—卵巢早衰—基因的生物學通路KEGG富集分析得到富集后信號通路133條，刪除與“cancer”相關的通路，并結合相關文獻進行篩選，根據校正后P值進行排序，篩選前30條進行氣泡圖繪制。結果顯示，相關信號通路包括腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）信號通路、凋亡相關信號通路、叉頭框轉錄因子O亞族（FoxO）信號通路、Toll樣受體信號通路、血管內皮生長因子（VEGF）信號通路、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路。見圖7、8。富集前10位細節見表2。

圖4 歸腎丸治療卵巢早衰的潛在靶標的BP分析Figure 4 Biological processes of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖5 歸腎丸治療卵巢早衰的潛在靶標的CC分析Figure 5 Analysis for cellular components of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

圖6 歸腎丸治療卵巢早衰潛在靶標的MF分析Figure 6 Analysis for molecular functions of candidate targets from Guishen Pills in treating POF

3 討論

圖7 前30位KEGG通路富集氣泡圖Figure 7 Bubble map for top 30 KEGG pathways enrichment

圖8 歸腎丸治療卵巢早衰“成分—靶標—通路”網絡關系圖Figure 8“Component-target-pathway”network of Guishen Pills in treating POF

3.1歸腎丸組方分析卵巢早衰的病因病機總以腎虛為主導，即所謂“經水出諸腎”“腎水本虛，何能盈滿化經水而外泄”。歸腎丸方中重用熟地黃以填精益髓，山茱萸、杜仲、當歸滋陰養血促進卵泡生長，菟絲子、枸杞子溫陽益氣，促進成熟卵泡排出，山藥、茯苓健脾培補后天以資先天。全方共奏補陰益陽、養血填精功效。

3.2歸腎丸活性成分分析通過分析得到歸腎丸治療卵巢早衰的活性成分有162個，包括槲皮素、大豆黃素、山萘酚、表兒茶素、豆甾醇、谷甾醇、β-谷甾醇等。其中，槲皮素、大豆黃素、山萘酚是黃酮類化合物，具有很好的抗炎、抗氧化應激等卵巢保護作用。有研究表明，槲皮素能夠增加自身免疫性卵巢早衰小鼠生長卵泡和成熟卵泡的比例，降低自身免疫性卵巢炎[19]，還具有一定的促進卵巢卵泡發育和成熟的作用而不影響卵巢壽命[20]。表兒茶素可以提高小鼠卵母細胞的mtDNA拷貝數及其發育潛能[21]。豆甾醇、谷甾醇均屬于植物甾醇，對去卵巢小鼠內源激素不平衡狀況可以明顯改善，而β-谷甾醇可明顯促進卵巢顆粒細胞分泌雌激素E2[22]。因此，可推測以上化合物是治療卵巢早衰的核心化合物。

表2 歸腎丸治療卵巢早衰KEGG通路富集前10位細節表Table 2 Data of top 10 KEGG pathways enrichment

3.3關鍵靶點分析通過對歸腎丸治療卵巢早衰的PPI網絡分析，其中AKT1、CASP3、MMP9、IL-6位于核心基因位置。AKT1是P13K/AKT信號通路的重要組成部分，在細胞生存和生長調控中起到重要作用。研究表明，將AKT1從小鼠原代顆粒細胞中去除后從轉錄組學及蛋白組學中評估其分子后果，發現AKT1不僅在細胞新陳代謝、凋亡、細胞周期、細胞肌動蛋白骨架調控中具有重要作用，在DNA修復、胞內運輸和線粒體功能上也有顯著改變[23]。CASP3是凋亡家族Caspase家族的明星蛋白，在卵巢生殖細胞和卵巢顆粒細胞中，CASP和Bcl2基因家族組成了促凋亡和抗凋亡易感基因[24]。卵泡閉鎖是導致卵巢儲備池過早衰竭的重要原因，而顆粒細胞凋亡是卵泡閉鎖所必須的，參與顆粒細胞凋亡的主要死亡受體配體系統是FAS和FASL系統，其后的細胞內信號激活Caspase 3導致DNA斷裂從而引起卵泡閉鎖[25]。MMP9是基質金屬蛋白酶（MMP）家族的重要組成成分，MMPs及其組織抑制劑（Timps）被廣泛認為是卵巢細胞外基質重構的關鍵因子，在動情周期中參與卵泡生長、排卵、黃體化和黃體溶解[26]。有研究表明，通過qRT-PCR檢測出哺乳動物的MMP9的mRNA在原始卵泡中含量最低，在早期卵泡中可檢測到峰值水平，而且在所有卵泡期的顆粒細胞中有特異性的高濃度的表達，說明MMPS家族，尤其是MMP9在卵泡腔的形成和擴張中起到了重要作用[27]。女性排卵一直被認為是復雜的炎癥反應過程，卵巢內或周圍的免疫細胞和促炎因子的改變都會對生殖功能產生深遠影響[28]。IL-6屬于是典型的免疫反應調節因子。研究表明，IL-6在體內外均可以調節胎鼠生殖細胞的存活、增殖和分化，并通過實驗驗證IL-6及其受體在人類胎兒卵巢中表達，并在生殖細胞的多個成熟階段發育過程中起到關鍵作用[29]。

3.4歸腎丸治療卵巢早衰核心信號通路分析通過查閱文獻，KEGG富集結果中TNF信號通路、FoxO信號通路、凋亡相關信號通路、PI3K/AKT信號通路等與卵巢早衰密切相關。卵巢排卵是一個復雜的生物過程[30]，而TNF信號通路是核心炎癥信號通路，TNF-α可通過發揮炎癥作用從而影響卵巢顆粒細胞通過自分泌和/或旁分泌機制來調節卵泡成熟和排卵[31]，在卵巢衰老[32]，顆粒細胞凋亡[33]、增殖[34]和分化[35]中均發揮重要作用。Fox是“Forkhead box”的縮寫，是根據在果蠅Fkh突變體中觀察到的異位頭結構而命名的，是Fox蛋白轉錄因子的超家族，參與壽命、抗應激、凋亡、細胞增殖、分化和代謝等多種生命體過程，在卵巢功能中也發揮了強大的調節作用[36]。其亞家族中研究比較多的主要包括FoxO3、FoxO4、FoxO6。FoxO3是目前研究最多，與卵巢中卵泡激活與卵巢功能密切相關的，有研究表明，FoxO3表達和哺乳動物的原始和初級卵泡密切相關[37]，當FoxO3被調控，小鼠的生殖周期顯著延長[38]。說明FoxO3蛋白可以作為一種調節因子，抑制原始卵泡的過度激活，增加卵巢儲備，從而延長女性生育周期[39]。凋亡信號通路是當前研究較為熱門的信號通路。Caspases家族如Caspase-3、Caspase-8是細胞內半胱氨酸蛋白酶家族的代表，有研究表明其作用與幾乎所有哺乳動物細胞凋亡的起始和終末階段都有聯系，其他如Bcl2家族、cAMP家族、PI3K/AKT通路都與Caspases級聯蛋白水解活性相互作用，而其他幾種內分泌和旁分泌調節分子也在調節顆粒細胞凋亡中發揮作用，如轉化生長因子α、表皮生長因子、成纖維細胞生長因子可以抑制細胞凋亡[40]。PI3K/AKT信號通路是許多正常細胞過程（包括細胞增殖、存活、生長、運動、細胞骨架重排和代謝）的關鍵調控因子[41]，越來越多的文獻證據證明，該通路是卵巢功能的關鍵調節因子，包括原始卵泡的休眠和激活、卵母細胞的維持和激活及減數分裂以及顆粒細胞和膜細胞的增殖和分化。各種因素導致的信號通路異常都可能導致原始卵泡耗竭從而導致不孕、卵巢早衰和原發性閉經[42]。通路的中間蛋白可以通過抑制BAX、BAD、Forkhead、p53等促凋亡蛋白，激活Bcl2等抗凋亡蛋白，進而促進細胞存活[43]，此外還可通過間接穩定cyclingD1和Myc等蛋白調控細胞周期進展。

綜上所述，歸腎丸治療卵巢早衰的作用機制與炎癥反應、氧化應激和凋亡等途徑相關。本研究基于網絡藥理學依靠數據庫信息在理論層面進行了初步探索，今后還需通過細胞與動物實驗進行進一步驗證。此外，目前的研究尚存在成分含量、相互作用以及體內代謝過程等因素的影響，今后尚需對歸腎丸治療卵巢早衰功效的物質基礎和藥效作用機制進行深入研究，以提高臨床用藥的合理性和科學性。