姜黃素下調miR-21-5p減輕缺氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞凋亡

謝瑾， 李紅， 羅浩

（1.四川大學華西醫院心內科，四川成都 610000；2.重慶醫科大學第一附屬醫院心內科，重慶 400016）

心肌缺血再灌注損傷可導致心肌組織的嚴重損傷和功能障礙[1-3]。尋找用于防治心肌缺血再灌注損傷的有效藥物一直是研究的熱點。姜黃為姜科植物Curcuma longa L.的干燥根莖。性溫，味辛、苦。有破血行氣、通經止痛的功效，用于治療胸脅刺痛、風濕肩臂疼痛、跌打腫痛等病癥。姜黃素（curcumin）是從姜黃中提取的一種相對分子質量小的多酚類物質，通常認為它是姜黃中最有效的成分，具有抗氧化、抗癌、抗炎和降血脂等作用[4-7]。已有研究表明，姜黃素對缺血再灌注大鼠心肌損傷具有保護作用[8]。基于此，本研究進一步觀察姜黃素對缺氧/復氧誘導的H9C2心肌細胞凋亡的影響，以期為開發和臨床應用姜黃素治療心肌缺血再灌注損傷提供實驗依據，現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1細胞培養大鼠心肌細胞株H9C2來源于美國模式培養物集存庫（American type culture collection，ATCC）。細胞以含體積分數10%胎牛血清和1%青鏈霉素的高糖DMEM培養基，于37℃、體積分數5%CO2恒溫培養箱中培養。每2～3 d更換1次培養基。實驗用細胞為處于對數生長期細胞。收集細胞時，用2.5 g/L胰蛋白酶消化。

1.2藥物與試劑姜黃素，購自中國食品藥品檢定研究院，批號：110823-201706。化學式：C21H20O6；分子量：368.38；純度≥98.7%。Hoechst 33258染色液、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒、LipoRNAiTM轉染試劑，均購自上海碧云天生物技術研究所；DMEM培養基、胎牛血清、胰蛋白酶、青—鏈霉素，購自美國Gibco公司；四甲基偶氮唑鹽（MTT）細胞增殖及細胞毒性測定試劑盒、乳酸脫氫酶（LDH）試劑盒，購自南京建成生物工程研究所；熒光素酶檢測試劑盒，購自北京索萊寶科技有限公司；Bcl-2、Bax、caspase-3、GAPDH等抗體（美國Abcam公司）。

1.3儀器YKY-1200型熒光顯微鏡，購自上海永科光學儀器有限公司；Nanodrop?DR6000分光光度計，購自美國哈希公司；318C+酶標儀，購自上海沛歐分析儀器有限公司；GT9611型PCR儀，購自杭州柏恒科技有限公司；SmartGel凝膠成像儀，購自天津賽歐斯科技有限公司。

1.4姜黃素對缺血/復氧心肌細胞的影響

1.4.1 細胞模型建立[9]及分組 將對數生長期的H9C2細胞隨機分為5組：空白對照組、缺氧/復氧組，姜黃素2.5、5、10μmol/L組[10]。除空白對照組外，其他各組用無糖DMEM培養基替換，置入體積分數5%CO2、95%N2的培養室內誘導缺氧4 h，再置于體積分數95%空氣、5%CO2培育箱中復氧3 h，將無糖DMEM培養基替換回高糖培養基。姜黃素2.5、5、10μmol/L組于缺氧前在培養基中分別添加姜黃素2.5、5、10μmol/L，空白對照組、缺氧/復氧組不做其他處理。

1.4.2 MTT法測定細胞活力 H9C2細胞復氧培養24 h后，將細胞接種于96孔板（100μL/孔），每組設3個復孔，置于37℃、含體積分數5%CO2細胞培養箱中培養24 h。每孔加入50μL MTT溶液，孵育4 h。吸出上清液，每孔加150μL二甲基亞砜（DMSO），用平板搖床搖勻。用酶標儀在570 nm波長處檢測各孔光密度（OD，D）值。

1.4.3 LDH活性測定 H9C2細胞復氧培養24 h后，取細胞上清液，按照試劑盒說明書，測定LDH活性。

1.4.4 Hoechst 33258染色法觀察細胞凋亡 消化收集細胞，吸盡培養液，加入0.5 mL固定液，固定10 min或更長時間（可4℃過夜）。去固定液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液。加入0.5 mL Hoechst 33258染色液，染色5 min。去染色液，用PBS洗2遍，每次3 min，棄液。滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上，蓋上貼有細胞的蓋玻片，讓細胞接觸封片液，盡量避免氣泡。在熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。凋亡細胞的細胞核呈亮藍色，亮藍色斑點密度代表細胞凋亡程度。

1.4.5 蛋白免疫印跡（Western Blot）法檢測心肌細胞缺氧/復氧條件下Bcl-2、Bax、caspase-3蛋白表達水平 將待測細胞用PBS清洗3次，加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白質含量。取等量的蛋白質樣品（20 mg），100℃變性5 min。十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰氨凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白并轉移至聚偏氟乙烯（PVDF）膜。體積分數5%BSA室溫封閉1～2 h。加入相應的一抗（抗Bcl-2抗體：1∶1 000稀釋；抗Bax抗體：1∶1 000稀釋；抗caspase-3抗體：1∶1 000稀釋；抗GAPDH：1∶10 000稀釋），4℃過夜孵育。次日，清洗后再加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1 h。清洗，加入發光液。應用凝膠成像儀進行曝光拍照，并用Image J軟件測灰度值，以GAPDH為內參，計算目的蛋白的相對表達量。至少重復3次。

1.4.6 逆轉錄—聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測心肌細胞缺氧/復氧條件下miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平 用TRIzol試劑提取心肌細胞總RNA，用分光光度計測定總RNA的D260/D280，判定RNA純度，計算出總RNA的含量。按照試劑盒說明書進行cDNA的合成和PCR的擴增，反應條件：94℃預變性5 min，94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，擴增35個循環，72℃延長10 min。反應產物用2%瓊脂糖凝膠電泳分離。以GAPDH為內參基因，2-△△Ct法計算miR-21-5p mRNA相對表達量。miR-21-5p上游引物序列為：5’-CGTTGA ATGTCACTCTGGTG-3’，下游引物序列為：5’-G GTCATTGTGTGCAGCTCAC-3’。Bcl-2上游引物序列為：5’-GGTGCCACCTGTGGTCCACCT-3’，下游引物序列為：5’-CTTCACTTGTGGCCCAGATAGG-3’。GAPDH上游引物序列為：5’-TGTGGGCATCA ATGGATTTGG-3’，下游引物序列為：5’-ACACC ATGTATTCCGGGTCAAT-3’。

1.5熒光素酶報告實驗檢測miR-21-5p與Bcl-2靶向關系通過TargetScan、mi Randa等靶基因預測軟件分析miR-21-5p和Bcl-2存在3’UTR的結合位點。構建野生型和突變型的Bcl-2 3’UTR熒光素酶報告載體，分別命名為Bcl-2 wt和Bcl-2 mut。熒光素酶質粒由Invitrogen公司設計合成。將H9C2細胞接種于24孔板，細胞隨機分為4組，即Bcl-2 wt+空質粒組、Bcl-2 wt+miR-21 mimic組、Bcl-2 mut+空質粒組、Bcl-2 mut+miR-21 mimic組，每組設3個復孔。Bcl-2 wt+空質粒組：將Bcl-2 wt和空質粒轉染至H9C2細胞；Bcl-2 wt+miR-21 mimic組：將Bcl-2 wt和miR-21-5p mimic轉染至H9C2細胞；Bcl-2 mut+空質粒組：將Bcl-2 mut和空質粒轉染至H9C2細胞；Bcl-2 mut+miR-21 mimic組：將Bcl-2 mut和miR-21-5p mimic轉染至H9C2細胞。應用lipofectamineTM2000轉染48 h后，通過雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒檢測細胞雙熒光素酶的活性。

1.6姜黃素對miR-21-5p mimic轉染心肌細胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響參照“1.4.1”項下方法，建立缺氧/復氧心肌細胞模型，將細胞隨機分為4組：空白對照組、姜黃素組、mimic組和姜黃素+mimic組。姜黃素組于缺氧前在培養基中添加姜黃素10μmol/L；mimic組轉染miR-21-5p mimic質粒；姜黃素+mimic組于缺氧前在培養基中添加姜黃素10μmol/L并轉染miR-21-5p mimic質粒。RT-PCR檢測miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平，Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡情況。

1.7姜黃素對si-Bcl-2轉染心肌細胞Bcl-2蛋白表達及凋亡率的影響參照“1.4.1”項下方法，建立缺氧/復氧心肌細胞模型并將細胞隨機分為4組：空白對照組、姜黃素組、si-Bcl-2組和姜黃素+si-Bcl-2組。姜黃素組于缺氧前在培養基中添加姜黃素10μmol/L；si-Bcl-2組轉染si-Bcl-2質粒；姜黃素+si-Bcl-2組于缺氧前在培養基中添加姜黃素10μmol/L并轉染si-Bcl-2質粒。以Western Blot法檢測Bcl-2蛋白表達水平，Hoechst 33258染色法檢測細胞凋亡情況。

1.8統計方法采用SPSS18.0統計軟件進行數據分析。正態分布的計量資料以均數±標準差（±s）表示，2組比較采用t檢驗，多組數據比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞增殖活力及LDH活性的影響圖1結果顯示：與空白對照組比較，缺血/復氧組細胞活力顯著降低（P＜0.01），LDH活性顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組細胞活力均升高，LDH活性均降低，并具有劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統計學意義（P＜0.01）。表明姜黃素可促進缺血/復氧心肌細胞的增殖活力，減輕細胞損傷。

圖1 姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞增殖活力及LDH活性的影響Figure 1 The effect of curcumin on proliferative activity and LDH activity in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

圖2 姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2表達的影響Figure 2 The effect of curcumin on the apoptosis rate and expression of apoptosis-related proteins of caspase-3，Bax and Bcl-2 in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.2姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞凋亡率及凋亡相關蛋白caspase-3、Bax、Bcl-2的影響圖2-A、-B結果顯示：與空白對照組比較，缺血/復氧組細胞凋亡率顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組細胞凋亡率均降低，并呈劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統計學意義（P＜0.01）。圖2-C、-D結果顯示：與空白對照組比較，缺血/復氧組細胞caspase-3、Bax蛋白表達水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組caspase-3、Bax蛋白表達水平降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達水平顯著降低（P＜0.01），均呈劑量依賴性。表明姜黃素可抑制缺血/復氧心肌細胞凋亡。

2.3姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影響圖3-A結果顯示：與空白對照組比較，缺血/復氧組miR-21-5p mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組miR-21-5p mRNA水平均顯著降低，并呈劑量依賴性，且姜黃素5、10μmol/L組差異有統計學意義（P＜0.01）。圖3-B結果顯示：與空白對照組比較，缺血/復氧組Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，姜黃素2.5、5、10μmol/L組Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），且呈劑量依賴性。表明姜黃素可降低miR-21及抗凋亡基因Bcl-2的表達。

圖3 姜黃素對缺血/復氧H9C2心肌細胞miR-21-5p mRNA、Bcl-2 mRNA水平的影響Figure 3 The effect of curcumin on the miR-21-5p mRNA and Bcl-2 mRNA expression in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

2.4 miR-21-5p與Bcl-2靶向關系搜索NCBI數據庫獲得Bcl-2 3’UTR序列，結果如圖4-A所示。采用熒光素酶報告實驗驗證，如圖4-B結果顯示：Bcl-2 wt+miR-21 mimic組熒光素酶活性較Bcl-2 wt+空質粒組、Bcl-2 mut+空質粒組、Bcl-2 mut+miR-21 mimic組顯著降低（P＜0.01）。表明miR-21-5p和Bcl-2存在直接靶向作用關系。

圖4 miR-21-5p與Bcl-2靶向關系Figure 4 Targeting relationship between miR-21-5p and Bcl-2

2.5姜黃素對miR-21-5p mimic轉染后缺氧/復氧H9C2心肌細胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響圖5-A、-B結果顯示：與缺血/復氧組比較，姜黃素組miR-21-5p mRNA水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）；與缺血/復氧組比較，mimic組miR-21-5p mRNA水平顯著升高（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著降低（P＜0.01）；與mimic組比較，姜黃素10μmol/L+mimic組miR-21-5p mRNA水平顯著降低（P＜0.01），Bcl-2 mRNA水平顯著升高（P＜0.01）。圖5-C結果顯示：姜黃素組細胞凋亡率顯著低于缺血/復氧組（P＜0.01），mimic組細胞凋亡率顯著高于缺血/復氧組（P＜0.01），姜黃素10μmol/L+mimic組細胞凋亡率顯著低于mimic組（P＜0.01）。表明姜黃素可靶向miR-21-5p抑制H9C2細胞凋亡。

圖5 姜黃素對miR-21-5p mimic轉染后缺氧/復氧H9C2心肌細胞miR-21-5p、Bcl-2 mRNA水平及凋亡率的影響Figure 5 The effect of curcumin on the mRNA expression levels of miR-21-5p and Bcl-2 and apoptosis rate in ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes transfected with a mir-21-5p mimic

2.6姜黃素對si-Bcl-2誘導的缺氧/復氧H9C2心肌細胞Bcl-2蛋白表達及凋亡率的影響圖6-A，-B結果顯示：姜黃素組Bcl-2蛋白水平較缺血/復氧組顯著升高（P＜0.01）；si-Bcl-2組Bcl-2蛋白水平較缺血/復氧組顯著降低（P＜0.01），si-Bcl-2組Bcl-2蛋白水平顯著低于姜黃素+si-Bcl-2組（P＜0.01）。圖6-C結果顯示：姜黃素組細胞凋亡率較缺血/復氧組顯著降低（P＜0.01），si-Bcl-2組細胞凋亡率較缺血/復氧組顯著升高（P＜0.01），姜黃素+si-Bcl-2組細胞凋亡率顯著低于si-Bcl-2組（P＜0.01）。表明姜黃素促進Bcl-2蛋白表達，抑制si-Bcl-2誘導的心肌細胞凋亡。

圖6 姜黃素對si-Bcl-2誘導的缺氧/復氧H9C2心肌細胞Bcl-2蛋白表達及凋亡率的影響Figure 6 The effect of curcumin on Bcl-2 protein expression and apoptosis rate in si-Bcl-2 transfected ischemia/reoxygenation-induced H9C2 cardiomyocytes

3 討論

心肌缺血再灌注損傷后會發生4種類型的心功能障礙，包括無復流現象、心肌頓抑、再灌注心率失常和致死性再灌注損傷[11]。目前，對心肌缺血再灌注損傷的機制有不同的解釋，如氧自由基理論[12]、鈣超載理論[13]和炎癥反應理論[14]。已有研究表明，心肌缺血再灌注損傷過程中會發生凋亡，凋亡在心肌最終梗死區域起決定性作用[15]。當使用特定藥物干預凋亡過程時，有效抑制凋亡可使心肌梗死面積達到70%，顯著改善心功能狀態[16]。因此，在臨床應用抗凋亡藥物治療心肌缺血再灌注損傷具有重要意義。LDH是活細胞胞漿內含酶之一，在正常情況下，其不能透過細胞膜，當靶細胞受損時，細胞膜通透性改變，LDH可釋放至介質中。因此，檢測LDH活性變化可反映細胞損傷情況[17]。本研究結果顯示，心肌缺血再灌注損傷細胞的細胞增殖活力降低，LDH活性增加，而姜黃素具有升高缺血再灌注誘導的心肌細胞活力，減輕細胞損傷的作用。

細胞凋亡也稱為程序性細胞死亡（PCD），而caspase-3是非常重要的起始因子[18]，其介導PCD過程。研究表明，caspase-3可以通過其自身的寡聚化切割而被激活，并且可以激活多種下游蛋白酶，并參與抑制細胞增殖和誘導細胞凋亡的過程[19]。下調caspase-3蛋白表達可保護心肌細胞免受缺氧/復氧損傷[20]。誘導凋亡級聯的機制主要有內在途徑和外在途徑，內在凋亡途徑中的關鍵事件是線粒體外膜的透化，其響應于各種刺激而發生，并且受若干細胞質蛋白調節[21]。促凋亡成員Bax位于線粒體外膜或細胞質，并在應激下寡聚化，促進線粒體釋放因子，從而引發細胞凋亡[22]。

Bcl-2基因在細胞存活和凋亡抑制中起關鍵作用[23]。臨床前研究表明，靶向抗凋亡Bcl-2家族成員的藥物具有臨床前活性[24]。抗細胞凋亡成員Bcl-2，可防止細胞凋亡。微小RNA（miRNA）是一類由內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，其可以直接調控細胞中超過30%的基因[25]。miRNA還參與多種生物學過程，是細胞分化、生長、增殖和凋亡的主要調控因子[26]。研究發現，miR-21通過抑制缺氧/復氧誘導的自噬和細胞凋亡，從而預防心肌缺氧/復氧損傷[27]。miRNA可通過靶向Bcl-2調控心肌細胞凋亡[28-30]。

本研究結果顯示，缺氧復氧誘導的H9C2細胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白表達水平升高，Bcl-2蛋白表達水平降低，姜黃素可下調缺氧/復氧誘導的H9C2細胞凋亡率及caspase-3、Bax蛋白水平，上調Bcl-2蛋白水平。表明姜黃素可抑制缺氧/復氧誘導的H9C2細胞凋亡。

本研究通過生物信息預測和熒光素酶報告實驗證實miR-21-5p和Bcl-2兩者之間存在靶向關系。本研究結果顯示，miR-21-5p mimic轉染H9C2細胞后miR-21-5p表達升高，Bcl-2表達降低，凋亡率升高，而用姜黃素處理后miR-21-5p表達則降低，Bcl-2表達則升高，凋亡率降低，表明姜黃素可靶向miR-21-5p抑制H9C2細胞凋亡。通過構建小干擾RNA干擾Bcl-2的表達，發現姜黃素可升高Bcl-2表達，抑制si-Bcl-2誘導的H9C2細胞凋亡。說明姜黃素可通過下調miR-21-5p表達解除對Bcl-2的抑制，進而抑制H9C2細胞凋亡。

綜上所述，姜黃素靶向miR-21-5p抑制缺血/復氧誘導的心肌細胞凋亡，通過下調miR-21-5p表達解除對Bcl-2的抑制，從而保護心肌細胞。