高效液相色譜法測定松藻多糖中醛糖的絕對構型

李娜?于金換

摘 要：本論文通過高效液相色譜（HPLC）法對3個松藻多糖組分進行單糖組成及單糖絕對構型的測定，該方法簡單快速，所需的高效液相色譜儀及C18色譜柱在實驗室普遍應用，為天然多糖中單糖絕對構型的測定提供參考。

關鍵詞：高效液相色譜法;醛糖;絕對構型

醛糖是生物分子中最重要的結構成分之一，如多糖、核酸、糖脂和糖蛋白等。此外，植物中存在大量的次生代謝物，如萜類、類固醇和類黃酮，它們與醛糖結合，以糖苷的形式存在。醛糖是具有旋光活性的化合物，在天然產物化學中需要確認其絕對構型。如果糖基的絕對構型沒有確定，一個復雜多糖的結構表征是不完整的。因此，更可靠和簡便的確定單糖絕對構型的方法是闡明復雜多糖完整結構的有價值的工具。目前已應用的測定方法有高效液相色譜法、氣液色譜或氣質聯用、毛細管電泳法。然而，使用配備紫外檢測器和C18反相柱的高效液相色譜來測定單糖絕對構型的研究并不多，本文采用一種簡便快速的高效液相色譜法鑒別松藻多糖中醛糖的絕對構型。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

單糖標準品、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP），美國Sigma-Aldrich公司;乙腈（色譜純），美國Tedia公司;L-半胱氨酸甲酯、異硫氰酸鄰甲苯酯等其它試劑均為國產分析純。Agilent Eclipse XDB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Agilent公司）;高效液相色譜儀（Agilent 1260，美國Agilent公司）。

1.2 方法

1.2.1 單糖組成分析

3個松藻來源的多糖組分分別為CP1、CP2、CP3，采用PMP柱前衍生高效液相色譜法對單糖組成進行分析。

柱前衍生：取完全酸水解樣品及濃度為10 mg/mL的標準品混合溶液各100 μL，加入120 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液和100 μL 0.3 mol/L的氫氧化鈉溶液，70 ℃水浴中反應1 h，然后加入100 μL 0.3 mol/L的HCl溶液終止反應，萃取，離心，上清液經0.22 μm的濾膜過濾，即可進行HPLC分析。

色譜條件：色譜柱為Agilent Ecli-pse XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱溫為35 ℃;檢測器為紫外檢測器（波長254 nm）;進樣量為10 μL;流動相為乙腈：磷酸鹽緩沖液=17∶83（V∶V）;流速為1.0 mL/min。

將樣品色譜圖與單糖標準品色譜圖比較，根據各峰的保留時間可知單糖種類，根據峰面積計算摩爾比。

1.2.2 單糖絕對構型（D/L）的測定

采用高效液相色譜法對3個松藻多糖中主要單糖種類的絕對構型進行測定[1]。

衍生物制備：取單糖標準品和完全酸水解的多糖樣品各2 mg，分別置于兩個EP管中，各加入2 mg L-半胱氨酸甲酯和0.4 mL吡啶，于60 ℃水浴反應1 h，然后加入2 mg異硫氰酸鄰甲苯酯，于60 ℃水浴中反應1 h，過濾，即可進行高效液相色譜分析。對比標準品和樣品的液相色譜圖上的保留時間，即可得知樣品中單糖的絕對構型。

色譜條件：色譜柱為Agilent Eclipse?XDB-C18（5 μm，4.6 μm×25.0 cm）;柱溫為35 ℃;檢測器為紫外檢測器（波長250 nm）;流動相為乙腈∶蒸餾水=25∶75（V∶V）;進樣量為10 μL;流速為0.8 mL/min。

2 結果與討論

2.1 單糖組成分析

將高效液相色譜圖將松藻多糖的保留時間與多糖標準品進行比較，單糖組成百分比結果顯示：CP1主要由49.52%的阿拉伯糖和48.75%的半乳糖組成，另外含有1.73%的葡萄糖;CP2主要含有96.44%的半乳糖，還有3.56%的葡萄糖;CP3主要含有85.4%的葡萄糖，還有10.38%的半乳糖和4.22%的甘露糖。

2.2 單糖絕對構型（D/L）的測定

采用高效液相色譜法測定多糖中主要單糖種類的絕對構型，僅適用于醛糖的測定。將單糖標準品和多糖樣品的液相色譜圖進行對比，根據保留時間，結合單糖組成測定結果得出，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，其絕對構型分別是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖組成，其絕對構型為D-Gal;CP3主要由葡萄糖組成，其絕對構型為D-Glc。

3 結語

本文對3個松藻多糖組分進行單糖組成及單糖絕對構型的測定，CP1主要由阿拉伯糖和半乳糖組成，其絕對構型分別是L-Ara和D-Gal;CP2主要由半乳糖組成，其絕對構型為D-Gal;CP3主要由葡萄糖組成，其絕對構型為D-Glc。本方法所使用的配備紫外檢測器和C18反相色譜柱的高效液相色譜系統是現在實驗室中常見的分析系統，簡單易行。目前正在優化反應條件，以期能應用于天然產物的結構測定。

參考文獻

[1]Tanaka T，Nakashima T，Ueda T，et al.Facile Discrimination of Aldose Enantiomers by Reversed-phase HPLC. Chemical & Pharmaceutical Bulletin，2007，55（6）：899-901.

基金項目：山東省高等學校科研發展計劃項目（編號：J18KA282）;煙臺職業學院校級課題（編號：2019001）。

作者簡介：李娜（1987—），女，山東青島人，博士，講師。研究方向：海藻多糖。