miR-182調控HIF-2α通路對低氧誘導子癇前期滋養細胞侵襲的影響

楊 娟，謝瑩鶯

子癇前期(pre-eclampsia，PE)是臨床上以孕產婦高血壓和尿蛋白為特征的多系統性疾病，世界上3%～5%的孕婦患有PE，是導致孕產婦及圍生兒死亡的一個重要因素[1]。目前PE病因和發病機制還未有統一定論，一般認為胎盤著床時期滋養細胞凋亡、侵襲能力降低導致胎盤淺著床，是PE病發的關鍵環節。妊娠早期細胞胎盤發育處于低氧狀態，是影響細胞侵襲的主要因素[2]。人miRNA長度一般為21～24個核苷酸，主要與靶基因3′UTR配對，抑制或降解靶基因mRNA翻譯，從而參與機體生理過程[3]。miR-182位于人7號染色體，可誘導產生基因沉默復合物(RNA-induced silencing complex，RISC)并與其結合，之后與靶基因mRNA完全或不完全堿基互補配對，導致其降解或抑制翻譯[4]。研究[5]表明miR-182可上調p38MAP信號通路，增強膽囊癌細胞侵襲能力。低氧誘導因子2α(hypoxia inducible factor 2α，HIF-2α)，也可稱為內皮PAS區域1(endothelial PAS domain protein 1，EPASI)，是低氧調節通路中的重要因子。HIF-2α在調節細胞適應低氧環境，調控細胞增殖、侵襲方面已有報道[6]。miR-182和HIF-2α都與細胞侵襲有關，因此該研究擬探討在低氧誘導PE細胞中miR-182、HIF-2α表達情況與細胞侵襲能力的關系，分析二者表達水平之間的聯系。

1 材料與方法

1.1 病例資源收集青海大學附屬醫院2016年12月～2018年12月期間自愿行剖宮產術的PE孕婦67例，年齡23.12～35.27(27.49±2.10)歲,孕周(36.21±1.26)周，在手術中PE孕婦胎盤娩出5 min內，以臍帶為中心取母體面中央區組織胎盤約1 cm33塊，生理鹽水沖洗干凈，置于液氮中待用(注：取樣時應避開出血、鈣化、機化胎盤組織，并由母體面至胎兒面貫穿取材)。另選同期自愿行剖宮產術的健康孕婦84例作為對照組，年齡23.46～34.18(26.84±2.13)歲，孕周(37.05±1.18)周，取材部位和大小同PE孕婦。納入標準：① 所有研究對象均簽訂知情同意書；② 本次妊娠正常，除PE外無其他并發癥；③ 無心臟病、糖尿病、高血壓、肝腎臟疾病；④ 孕婦均為第一次妊娠，單胎。排除標準：① 孕婦有流產史；② 胎兒畸形；③ 孕婦產期有吸煙史或服用藥物。

1.2 儀器與試劑DMEM培養液、胎牛血清購自美國Sigma公司；Matrigel、Transwell板、胰蛋白酶、青鏈霉素雙抗購自美國Sigma公司；總RNA提取試劑盒(貨號：R1200)購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗人HIF-2α、兔抗人血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、兔抗人E-鈣黏蛋白(E-cadherin)、兔抗人基質金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9，MMP-9)、兔抗人MMP-2、兔抗人內參β-actin、羊抗兔二抗購自美國Bioworld公司；miR-182 inhibitor由上海生工生物公司合成；CFX96型實時熒光定量儀購自美國BIO-RAD公司；Multiskan FC酶標儀購自美國賽默飛公司；SC-Y408A光學顯微鏡購自深圳市晨晟光學儀器有限公司。

1.3 細胞培養、轉染與分組HTR8/SVneo人早孕期絨毛外滋養細胞株購自中科院細胞庫；培養箱溫度設為37 ℃、5 % CO2，相對濕度為98 %。將細胞以5×105個/孔的密度接種到6孔板上，待細胞融合率在50 %左右時棄去培養液，用LipofectamineTM2000法進行轉染(試劑配制：2 μl LipofectamineTM2000與100 μl轉染復合物混合均勻)，25 ℃孵育10 min，用Opti-MEM將miR-182 inhibitor、miR-182陰性對照序列(miR-182無關序列)濃度調整為20 μmol/L，25 ℃孵育10 min，將miR-182 inhibitor、等體積培養基、miR-182 inhibitor陰性對照分別與LipofectamineTM2000混合均勻，25 ℃孵育20 min，加入到含有HTR8/SVneo細胞的6孔板中，培養箱培養24 h。實驗分組：① 對照組；② 低氧組；③ miR-182 inhibitor組；④ miR-182 inhibitor陰性對照組。除對照組外，其余組都在低氧環境下培養(37 ℃、1% O2、94% N2和5% CO2)

1.4 RT-qPCR檢測胎盤中miR-182表達水平使用RNA提取試劑盒提取胎盤中總RNA，反轉錄得到cDNA，采用實時熒光定量PCR儀對miR-182進行擴增。擴增體系共20.0 μl，其中cDNA(50 ng/ml) 2.0 μl，SYBR Mix10.0 μl，ddH2O 4.0 μl，上下游引物(5 μmol/L)各2.0 μl。反應條件：94 ℃預變性30 s，94 ℃變性30 s，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸45 s，擴增35個循環后，72 ℃終末延伸10 min。miR-182及內參U6的引物序列見表1。3個復孔，采用2-ΔΔCt法對miR-182表達水平進行定量分析。

1.5 Western blot測定胎盤中HIF-2α、VEGF表達水平和HTR8/SVneo細胞中HIF-2α、VEGF、E-cadherin、MMP-9、MMP-2表達水平用RIPA法提取各組細胞總蛋白，BCA法測定各組蛋白總含量。50 μg蛋白加入到點樣孔中，用凝膠電泳分離目標蛋白，轉至PVDF膜上，5 % BSA將結合位點封閉1 h。加入兔抗人HIF-2α、兔抗人VEGF、兔抗人E-cadherin、兔抗人MMP-9、兔抗人MMP-2、兔抗人內參β-actin(1 ∶1 500)，孵育24 h，用PBS清洗3次，加入羊抗兔二抗(1 ∶5 000)，25 ℃孵育30 min，PBS清洗3次，顯色、曝光、觀察。

表1 miR-182和內參U6引物序列

1.6 流式細胞儀測定HTR8/SVneo細胞凋亡率將HTR8/SVneo細胞經胰酶消化后轉移至10 ml無菌離心管中，在25 ℃離心半徑10 cm、1 000 r/min下離心5 min，棄上清液，用預冷的PBS洗滌，之后加入2 ml PBS重懸細胞，按照上述步驟再次離心、洗滌細胞，重懸后用預冷的PBS調整細胞密度為2×107個/ml。用Annexin V-FITC/PI試劑盒標記細胞，流式細胞儀檢測細胞凋亡率(激發波長：488 nm，發射波長：525 nm)。

1.7 Transwell侵襲實驗測定HTR8/SVneo細胞侵襲能力從-20 ℃冰箱中取出Matrigel，放置在4℃環境中解凍，用無血清培養液將Matrigel稀釋到100 μl/ml，以400 μl/cm2的用量涂抹到transwell板的濾膜面上，在培養箱放置4 h，之后在超凈臺上干燥，將對數生長期的HTR8/SVneo以1×105個/ml密度接種到Transwell上室，下室加入600 μl含血清的培養液，培養至細胞貼壁后更換上下室的培養液，實驗分組同1.2項并設置6個復孔，繼續培養24 h后，輕輕拭去Matrigel和上室內細胞，固定10 min后，用PBS清洗3次，用結晶紫(0.1 %)染色10 min，用PBS清洗3次。使用顯微鏡觀察拍照，選擇6個視野計數，結果取平均值。

1.8 雙熒光素酶實驗檢測miR-182與HIF-2α靶標關系

1.8.1熒光素酶報告實驗突變型載體的制備 用TargetScan分析HIF-2α序列3′UTR區域3個miR-182結合區域進行擴增，之后與PGEM-T載體相連，根據測序篩選出的目標序列，用連接酶將其與熒光素酶報告載體pGL4相連，構建p-GL4-HIF-2α-3'UTR質粒，以p-GL4-HIF-2α-3'UTR質粒為模板對HIF-2α-3'UTR進行定點缺失突變(Del1，Del2，Del3)，測序篩選，進一步構建p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del、p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del2、p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del3和p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del1，Del2，Del3質粒。

1.8.2熒光素酶測試報告實驗 將HTR8/SVneo細胞接種到24孔板上，培養24 h后，將p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del、p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del2、p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del3和p-GL4-HIF-2α-3'UTR-Del1，Del2，Del3質粒與miR-182 inhibitor、miR-182空白對照共轉染，設置6個復孔，培養24 h后，每組細胞各加入熒光素酶檢測試劑Ⅱ 100 μl，酶標儀測定熒光強度，隨后加入Stop&Glo試劑，再次用酶標儀測定熒光強度，以前后熒光強度比值表示熒光素酶的相對活性。

2 結果

2.1 胎盤組織中miR-182、HIF-2α、VEGF表達水平與對照組相比，PE患者胎盤組織中miR-182表達水平降低，HIF-2α、VEGF蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖1和表2。

圖1 胎盤組織中HIF-2α、VEGF表達水平

表2 胎盤組織中miR-182、HIF-2α、VEGF表達水平

2.2 miR-182 inhibitor轉染處理后HTR8/SVneo細胞miR-182、HIF-2α、VEGF表達情況與對照組相比，低氧組miR-182表達水平降低，HIF-2α、VEGF蛋白表達水平升高(P<0.05)；與低氧組、miR-182 inhibitor陰性對照組比較，miR-182 inhibitor組miR-182表達水平降低，HIF-2α、VEGF蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖2和表3。

圖2 HTR8/SVneo細胞HIF-2α、VEGF蛋白表達情況

A：對照組；B：低氧組；C：miR-182 inhibitor陰性對照組；D：miR-182 inhibitor組

表3 HTR8/SVneo細胞HIF-2α、VEGF蛋白表達情況

與對照組比較：*P<0.05；與低氧組比較：#P<0.05；與miR-182 inhibitor陰性對照組比較：△P<0.05

2.3 miR-182 inhibitor轉染處理后HTR8/SVneo細胞凋亡率與對照組相比，低氧組HTR8/SVneo細胞凋亡率升高(P<0.05)；與低氧組、miR-182 inhibitor陰性對照組比較，miR-182 inhibitor組細胞凋亡率降低(P<0.05)，見圖3和表4。

表4 各組HTR8/SVneo細胞凋亡率比較

與對照組比較：*P<0.05；與低氧組比較：#P<0.05；與miR-182 inhibitor陰性對照組比較：△P<0.05

2.4 HTR8/SVneo細胞侵襲能力與對照組相比，低氧組HTR8/SVneo細胞侵襲能力降低(P<0.05)；與低氧組、miR-182 inhibitor陰性對照組比較，miR-182 inhibitor組細胞侵襲能力升高(P<0.05)，見圖4和表5。

圖3 各組HTR8/SVneo細胞凋亡率比較

A：對照組；B：低氧組；C：miR-182 inhibitor陰性對照組；D：miR-182 inhibitor組

圖4 各組HTR8/SVneo細胞侵襲能力

A：對照組；B：低氧組；C：miR-182 inhibitor陰性對照組；D：miR-182 inhibitor組

表5 各組HTR8/SVneo細胞侵襲能力

與對照組比較：*P<0.05；與低氧組比較：#P<0.05；與miR-182 inhibitor陰性對照組比較：△P<0.05

2.5 miR-182 inhibitor轉染處理后HTR8/SVneo細胞E-cadherin、MMP-9、MMP-2表達水平與對照組相比，低氧組E-cadherin蛋白表達水平升高，MMP-9、MMP-2蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高(P<0.05)。與低氧組、miR-182 inhibitor陰性對照組比較，miR-182 inhibitor組E-cadherin蛋白表達水平降低，MMP-9、MMP-2蛋白表達水平升高(P<0.05)，見圖5和表6。

圖5 HTR8/SVneo細胞E-cadherin、MMP-9、MMP-2表達水平

A：對照組；B：低氧組；C：miR-182 inhibitor陰性對照組；D：miR-182 inhibitor組

表6 HTR8/SVneo細胞E-cadherin、MMP-9、MMP-2表達水平

與對照組比較：*P<0.05；與低氧組比較：#P<0.05；與miR-182 inhibitor陰性對照組比較：△P<0.05

2.6 miR-182與HIF-2α靶標關系Targetscan分析表明，miR-182序列3'UTR區存在3個HIF-2α結合位點。熒光素酶報告實驗顯示，與miR-182 inhibitor陰性對照組比較，miR-182 inhibitor野生型HIF-2α組的熒光素酶相對活性降低(P<0.05)。與miR-182 inhibitor野生型HIF-2α組比較，miR-182 inhibitor突變型HIF-2α組的熒光素酶相對活性均升高(P<0.05)，見表7。

3 討論

滋養細胞保持正常的生理功能對保證孕婦形成正常胎盤和維持正常妊娠十分重要，胎盤的形成依賴于滋養細胞的分化和侵襲，該生理過程一般在低氧條件下形成，子宮免疫失調會引起滋養細胞增殖、侵襲能力下降，導致胎盤供血不足，使胎盤低氧，誘發PE，低氧環境又會影響細胞增殖、侵襲能力[7]。因此研究如何增強低氧環境下PE細胞侵襲能力對治療PE意義重大。

表7 HTR8/SVneo細胞熒光素酶的相對活性

miR-182在調控細胞增殖、侵襲、遷移方面受到廣泛關注，研究[8]表明，miR-182能夠調控FOXF2基因，促進血管生成，增強三陰性乳腺癌細胞的侵襲能力，提示其可能是引起三陰性乳腺癌轉移的因素之一。Wang et al[9]發現miR-182通過調控NSCLC細胞中的HIF-1α表達來促進葡萄糖的代謝和乳酸釋放，從而增強NSCLC細胞的增殖能力。本研究顯示miR-182在PE孕婦胎盤組織中低表達，提示其可能與PE有關。細胞實驗顯示，與對照組相比，低氧組HTR8/SVneo細胞凋亡率升高，侵襲力降低，提示低氧可誘導人絨毛外滋養細胞凋亡。經miR-182 inhibitor轉染處理后，miR-182 inhibitor組HTR8/SVneo細胞中miR-182表達水平降低，細胞凋亡率降低，提示下調miR-182表達能緩解低氧所致人絨毛外滋養細胞損傷。基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMPs)屬于蛋白水解酶家族，能夠水解細胞外基質，研究顯示MMP-9和MMP-2表達含量與滋養細胞侵襲能力呈正相關，是體現侵襲能力的關鍵水解酶[10]。E-cadherin廣泛分布在細胞上皮表面，在增強細胞間相互作用、維持細胞完整性、胚胎發育方面發揮重要作用[11]。本研究顯示，與對照組相比，低氧組HTR8/SVneo細胞侵襲能力、MMP-9蛋白表達水平、MMP-2蛋白表達水平降低，E-cadherin蛋白表達水平升高；與低氧組、miR-182陰性對照組比較，miR-182 inhibitor組細胞侵襲能力、MMP-9蛋白表達水平、MMP-2蛋白表達水升高，E-cadherin蛋白表達水平降低。提示低氧誘導后細胞侵襲能力降低，下調miR-182表達能夠增強細胞侵襲能力，但是具體通過調控哪種信號通路還有待進一步研究。

HIF-2α在正常環境或組織中低表達，在病理組織特別是缺血缺氧組織中高表達，發揮保護因子的作用，調控機體適應缺氧環境。王建國 等[12]研究表明，在低氧條件下，HIF-2α能夠激活Notch3信號通路，從而上調Snail蛋白表達水平，下調E-cadherin蛋白表達水平，提高MCF-7細胞的侵襲和遷移能力。隨后研究發現，HIF-2α能夠上調VEGF，進而促進Notch表達來調控高強度聚焦超聲殘余肝癌新血管的生成[13]。臨床研究[14]發現，HIF-2α和VEGF在PE患者胎盤組織中的高表達，提示二者可能通過某種機制參與進程。本研究表明，HIF-2α和VEGF在PE孕婦胎盤組織中高表達，提示PE孕婦胎盤處于缺氧狀態，可誘導HIF-2α和VEGF表達上調。進一步分析顯示，與對照組相比，低氧組HTR8/SVneo細胞HIF-2α和VEGF表達水平升高；miR-182 inhibitor轉染處理后，miR-182 inhibitor組HTR8/SVneo細胞中miR-182水平降低，HIF-2α、VEGF蛋白表達水平升高，可能與促進HTR8/SVneo細胞侵襲有關。TargetScan數據庫預測顯示miR-182序列3'UTR區存在3個HIF-2α結合位點，雙熒光素酶實驗證實HIF-2α是miR-182作用靶點，提示miR-182可能通過靶向調控HIF-2α蛋白表達，激活HIF-2α/VEGF信號通路，上調MMP-9、MMP-2表達水平，下調E-cadherin表達水平，促進低氧條件下HTR8/SVneo細胞侵襲能力。

綜上所述，miR-182在PE患者胎盤組織中低表達，HIF-2α蛋白高表達，miR-182可能通過激活HIF-2α/VEGF信號通路，增強低氧條件下滋養細胞侵襲能力，推測miR-182有望成為治療PE的新靶點。但miR-182在子癇前期發生發展進程中表達情況仍需進一步研究。