預(yù)給七葉蓮花醇提物對大鼠布比卡因毒性影響

祝勁松,張 洋,劉 蕾,羅 君,吳 仲,鄒小華

布比卡因(bupivacaine，BPV)中毒因其具有神經(jīng)阻滯作用，是臨床麻醉實施過程中可能致命的一種并發(fā)癥。七葉蓮花醇提物具有抗感染鎮(zhèn)痛的作用，也已被廣泛應(yīng)用[1]。七葉蓮花醇提物對大鼠胸膜炎具有顯著的抑制作用[2]。目前國內(nèi)外七葉蓮花醇提物對BPV所致中樞及心臟毒性影響的研究較少。該研究以大鼠抽搐發(fā)作開始反映BPV所致中樞毒性，通過比較3種不同劑量七葉蓮花醇提物預(yù)先給藥組與生理鹽水預(yù)處理組大鼠發(fā)生抽搐、室性心律失常和心跳停止時BPV的用量，出現(xiàn)抽搐時各組大鼠血氣分析情況，術(shù)后qRT-PCR測定的各組間N-甲基-D天冬氨酸受體(N-methyl D-aspartate receptor, NMDAR)1亞基與2B亞基表達水平比較情況，探討七葉蓮花醇提物是否能夠在BPV中毒的救治中發(fā)揮作用。

1 材料與方法

1.1 動物與分組60只10周齡健康雄性成年SD大鼠，體質(zhì)量200～350 g，清潔級，購自南通大學(xué)實驗動物中心，動物許可證號：SCXK(蘇)2018-0001，分為4組(n=15)。

1.2 藥品、給藥方式及主要試劑取七葉蓮花以60%乙醇溶液滲漉提取，減壓濃縮成浸膏，由南京歐際醫(yī)藥科技服務(wù)有限公司提取制備，試驗時給大鼠灌胃給藥。鹽酸BPV( 上海aladdin，B129864)，用微量注射泵經(jīng)股靜脈泵入。qRT-PCR主要試劑：TRIpure Reagent(北京Aidlab,272026AX)；oneScriptTMcDNA Synthesis Kit(加拿大abm，G234)；EvaGreen Express 2×qPCR MasterMix-ROX(加拿大abm，MasterMix-ER)。

1.3 實驗步驟所有大鼠禁食不禁水12 h后進行灌胃處理，每天1次，連續(xù)3 d。對照組(D組)灌注生理鹽水，另外3組分別灌注七葉蓮花醇提物2、4、8 g/kg(S1、S2、S3組)。先行水合氯醛(10%)腹腔注射，并維持大鼠持續(xù)的純氧吸氧狀態(tài)，待麻醉起效后，選取SD大鼠右側(cè)腹股溝，備皮消毒，在股動脈搏動最強及內(nèi)側(cè)股靜脈處穿刺并置入套管，分別連接換能器動態(tài)測定大鼠平均動脈血壓(mean arterial pressure, MAP)。此外，所有大鼠經(jīng)股靜脈勻速泵注0.5% BPV 2 mg/(kg·min)。用銀針分別刺入大鼠雙上肢與左下肢，連接模擬導(dǎo)聯(lián)心電圖，主要監(jiān)測給藥過程中心電圖的變化。運用新生兒氧飽和度探測頭監(jiān)測大鼠給藥過程中血氧飽和度SpO2的變化。大鼠靜脈泵注BPV 2 mg/(kg·min)可作為誘發(fā)全身毒性實驗?zāi)Ｐ汀Ｓ^察記錄大鼠出現(xiàn)抽搐、心律失常(以心室除極期QRS波延長為標準)和心跳停止時(從開始輸注BPV的時刻計時)，BPV的用量。在大鼠出現(xiàn)抽搐時采動脈血行血氣分析，并測定SpO2。參照大鼠腦解剖圖譜，采用無齒鑷完整取出鼠的大腦，從取出的鼠大腦中分離出海馬，用組織剪將邊緣不整齊部分剪去，將其修剪成0.3 cm3大小的組織塊，進行qRT-PCR檢測。具體方法步驟參照abm試劑盒說明書。引物信息如下：

基因正向引物(5'-3')反向引物(5'-3')β-ActinTGCTATGTTGCCCTAGACTTCGGTTGGCATAGAGGTCTTTACGGNMDAR1GATAGAAAGAGTGGTAGAGC CCAGGGTGGAGGTGATAGCCNMDAR2BACCAATAAGCCAGTGGTGGTCCACAGGGGTTGGACTGGTTC

2 結(jié)果

2.1 BPV的用藥量大鼠局部麻藥中毒出現(xiàn)抽搐、心律失常和心跳停止時，S1、S2和S3組的局麻藥用量大于D組，S2組和S3組的用量也大于S1，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，S2組和S3組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。大鼠出現(xiàn)抽搐時，F(xiàn)=96.673；心率失常時，F(xiàn)=194.671；心跳停止時的F=99.544。見表1。

2.2 MAP和心率(heart rate,HR)變化與泵注

表1 4組大鼠出現(xiàn)中毒反應(yīng)時局麻藥用量的比較

與D組比較：**P<0.01；與S1組比較：△△P<0.01；與S3組比較：▲P<0.05，▲▲P<0.01

BPV前比，大鼠出現(xiàn)抽搐及心率失常時的MAP顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，HR有所降低。心律失常時MAP較抽搐時呈現(xiàn)輕微程度降低。S1、S2、S3組大鼠心率失常時與泵注BPV前相比，MAP及HR差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。統(tǒng)計學(xué)分析大鼠出現(xiàn)抽搐時的MAP差異，F(xiàn)=84.761；出現(xiàn)心率失常時的MAP差異，F(xiàn)=32.869；大鼠出現(xiàn)心率失常時的HR差異，F(xiàn)=5.194。見表2。

2.3 各組大鼠pH、PaCO2、PaO2、SaO2、SpO2分析結(jié)果S1、S2和S3組大鼠抽搐時PaCO2均高于D組，且S3組與D組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。S1、S2、S3組大鼠泵注BPV前及抽搐時的pH、PaO2、SaO2、SpO2與D組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。各組間pH、PaO2、SaO2、SpO2的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05) 。見表3。

2.4 心臟組織病理檢查D組大鼠可見炎細胞浸潤，間質(zhì)充血或出血明顯。S1、S2、S3組大鼠間質(zhì)炎細胞浸潤較D組明顯減輕，間質(zhì)輕微充血或輕微出血。各組大鼠心肌細胞均無明顯變性、壞死。4組大鼠心臟組織HE切片病理檢查見圖1。

表2 4組大鼠不同時間點MAP及HR的變化

與泵注BPV前比較：**P<0.01

表3 4組大鼠pH、PaCO2、PaO2、SaO2、SpO2分析結(jié)果比較

與D組比較：*P<0.05

圖1 四組大鼠心臟組織HE切片 ×200

Fig1、Fig2、Fig3、Fig4：D組、S1組、S2組、S3組大鼠的心臟組織HE切片病理檢查圖

2.5 qRT-PCR測定NMDAR 1亞基與2B亞基S1、S2、S3組大鼠NMDAR 1亞基與2B亞基相對表達量均較D組大鼠相比降低，D組最高，且S1、S2、S3組表達量依次降低。S1、S2、S3組NMDAR 1亞基與D組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。S2、S3組NMDAR 2B亞基與D組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。S1組NMDAR 2B亞基與D組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。統(tǒng)計學(xué)分析結(jié)果：A圖，F(xiàn)=19.106；B圖，F(xiàn)=5.332。見圖2。

圖2 4組大鼠NMDAR 1亞基與2B亞基的表達

A、B：4組大鼠NMDA受體1亞基與2B亞基的相對表達量；與D組比較：*P<0.05，**P<0.01

3 討論

BPV快速靜脈注射可產(chǎn)生嚴重中樞神經(jīng)和心臟毒性反應(yīng)，復(fù)蘇困難，病死率高，因其可抑制心肌電傳導(dǎo)而導(dǎo)致心律失常[3]。鉀離子通道開放劑，鈣通道阻滯劑等藥物經(jīng)常用于防治BPV引起的心臟毒性作用，但起效慢[4]。據(jù)報道[5]，預(yù)注右美托咪定可以降低BPV的急性中樞神經(jīng)系統(tǒng)毒性；脂肪乳預(yù)先給藥能減弱BPV所致鼠神經(jīng)系統(tǒng)和心臟毒性的影響[6]；生脈注射液，一種被廣泛用于心源性休克患者臨床治療的中藥注射劑，對BPV所致大鼠的心臟毒性有一定的預(yù)防作用[7-8]。本研究以等效麻醉劑量模擬麻醉過程中局麻藥系統(tǒng)毒性，觀察3種不同劑量七葉蓮花醇提物預(yù)先給藥對BPV致大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)和心臟毒性反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，七葉蓮花醇提物預(yù)先給藥延長了大鼠出現(xiàn)抽搐、室性心律失常和心跳停止的時間，提高了大鼠抽搐、心律失常和心跳停止時BPV的劑量。初步呈現(xiàn)出預(yù)防BPV毒性的作用。而且結(jié)果比較顯示2、4、8 g/kg 的七葉蓮花醇提物解救中樞中毒效果逐漸增強。血氣分析結(jié)果顯示：各組大鼠抽搐時與泵注BPV前相比，pH、PaO2、SaO2、SpO2值均有所降低，而動脈血二氧化碳分壓PaCO2值有明顯升高。大鼠泵注BPV出現(xiàn)抽搐時MAP升高，HR降低，與相關(guān)研究[5,9]結(jié)果類似。心臟組織HE切片病理檢查顯示D、S1、S2、S3組大鼠間質(zhì)可見炎細胞浸潤，間質(zhì)充血或出血明顯，表明BPV致使大鼠心臟毒性的發(fā)生。NMDAR 1亞基與2B亞基是反應(yīng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否受損的重要指標，海馬是學(xué)習(xí)記憶的關(guān)鍵腦區(qū)，NMDAR活化構(gòu)成了學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)，其數(shù)量和組成異常會嚴重損害認知功能，S1、S2、S3組大鼠NMDAR 1亞基與2B亞基相對表達量均較D組大鼠相比均降低，且3組表達量依次降低。該研究表明七葉蓮花醇提物預(yù)先給藥可通過減輕興奮性氨基酸毒性而減輕BPV對大鼠的中樞毒性，這與布美他尼(30 mg/kg)在大鼠缺血早期可以減少海馬CA1區(qū)NMDAR1的表達，減少興奮性氨基酸與受體結(jié)合，從而減少興奮性氨基酸毒性結(jié)果相似[10]。而七葉蓮花醇提物是否通過減輕興奮性氨基酸毒性而減輕BPV對大鼠的中樞毒性有待進一步證實。