染料木素對乳腺癌細胞睪丸特異性蛋白酶50表達的影響①

馮 磊 李 響 孟繁平 李 妍

(延邊大學醫學院免疫學與病原微生物學教研室，延吉 133002)

乳腺癌作為女性發病率最高的腫瘤，嚴重危害女性健康[1]。亞洲人廣泛攝取雌激素結構類似物，即植物性雌激素的豆科植物及中藥材，染料木素(genistein，Gen)等植物性雌激素的日常飲食攝入是否可促進乳腺癌細胞生長尚存爭議[2-4]。睪丸特異性蛋白酶50(testes-specific protease 50，TSP50)是近年發現的促癌基因，與乳腺癌復發密切相關[5]。約70%乳腺癌為雌激素受體陽性型(ER+)，內源或外源雌激素對癌細胞有生長促進作用[6]。本研究通過探討不同濃度Gen對人乳腺癌細胞中TSP50表達的影響，闡明植物性雌激素對乳腺癌細胞增殖的影響，為揭示TSP50在雌激素非基因組中的效應提供研究依據。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌細胞株MCF-7和MDA-MB-231購自中南大學湘雅醫學院；1640培養液、馬血清購自美國Gibco公司；DMEM/F12培養基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自美國Corning公司；TSP50兔抗人免疫組化抗體購自美國Novus公司；通用型二抗購自北京中杉金橋公司；垂直板電泳槽購自美國伯樂公司；流式細胞儀購自美國貝克曼公司；酶標儀購自北京普天公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 復蘇MCF-7細胞接種于10% 1640培養液的培養瓶中，置于37℃、5%CO2增殖培養，培養瓶中細胞生長超過80%時，胰酶消化傳代至達到實驗所需細胞量。

1.2.2MTT還原實驗 取對數期MCF-7細胞鋪于96孔板給藥，24 h后取上清，加入新的含血清培養基200 ml/孔，按1∶10加入MTT試劑，37℃培養。4 h后終止培養，每孔加入200 μl DMSO溶解甲臢結晶，37℃溫育10 min，將結晶溶解后的液體分裝于96孔酶標板內，每份設置3個復孔，200 μl/孔，酶標儀490 nm 處檢測各孔吸光度值，取3次試驗平均值。

1.2.3細胞周期檢測 固定好的細胞液1 000 r/min離心5 min；冷PBS洗滌細胞團塊2次， PI染液懸起洗滌過的細胞團塊，300目尼龍網過濾，轉入流式管，避光染色30 min,檢測并分析細胞周期。

1.2.4免疫熒光染色檢測膜分子 直接免疫熒光法檢測膜分子CD24、CD44和CD326表達，稀釋熒光抗體，加入1×106個細胞中，懸起細胞，避光染色。30 min后PBS洗滌2次，轉入流式管檢測。以膜分子表達陽性細胞的百分率或細胞膜上該分子表達的熒光強度代表實驗結果。

1.2.5免疫印跡分析乳腺癌細胞TSP50表達 取25 μl蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，移至PVDF膜，封閉液室溫封閉2 h，加一抗兔抗小鼠 MMP-2 或β-actin 抗體，4℃孵育過夜；TBS-T洗3次，每次10 min，加入山羊抗兔二抗室溫孵育1 h,TBS-T洗3次，每次10 min；ECL化學發光試劑顯影,Image One軟件定量分析。

1.2.6免疫組化 取對數生長期細胞MCF-7和MDA-MB-231，接種于24孔板，培養板底面積細胞覆蓋至60%～70%時，收集細胞爬片，經固定、脫水、染色、封片、拍照后鏡下觀察產生棕色沉淀為陽性。

2 結果

2.1免疫組化法觀察乳腺癌細胞中TSP50表達情況 免疫組化鏡下觀察細胞內產生棕色沉淀為陽性，結果顯示2種乳腺癌細胞中TSP50表達均呈陽性，見圖1。

2.2免疫印跡法測量2種乳腺癌細胞TSP50、MMP-2表達情況 結果顯示，TSP50和MMP-2在MCF-7和MDA-MB-231細胞中均表達，MDA-MB-231細胞中較高。因此MDA-MB-231為轉移和侵襲能力高的乳腺癌細胞，見圖2。

2.3免疫組化觀察增殖乳腺癌細胞TSP50表達情況 與正常乳腺癌細胞相比，處于分裂增殖期的乳腺癌細胞TSP50著色加深，見圖3，TSP50表達增強，MCF-7細胞TSP50表達最強。

圖1 乳腺癌細胞中TSP50表達情況(×400) Fig.1 Expression of TSP50 on breast cancer cell lines(×400)

圖2 乳腺癌細胞中TSP50和MMP-2表達Fig.2 TSP50 and MMP-2 expression on breast cancer cell lines

圖3 分裂增殖的乳腺癌細胞TSP50表達(×400)Fig.3 Expression of TSP50 in proliferative breast cancer cells(×400)

圖4 Gen對乳腺癌細胞生長的影響Fig.4 Effect of Gen on growth of breast cancer cell linesNote:Compared with control，*.P<0.05，**.P<0.05.

圖5 Gen對MCF-7細胞周期的影響Fig.5 Effect of Gen on cell cycle in MCF-7 breast cancer cells

圖6 Gen對MDA-MB-231細胞周期的影響Fig.6 Effect of Gen on cell cycle in MDA-MB-231 breast cancer cells

2.4MTT還原法檢測不同濃度Gen對乳腺癌細胞生長的影響 2.5～10 μmol/L Gen促進乳腺癌細胞生長，25～100 μmol/L Gen對乳腺癌生長呈抑制作用。Gen對MCF-7細胞20%生長促進的濃度為5～10 μmol/L，20%生長抑制濃度為12.5～25 μmol/L，而50%生長抑制濃度為50～100 μmol/L，見圖4。

2.5流式細胞術檢測Gen對乳腺癌細胞周期的影響 與對照組相比，5 μmol/L Gen 導致MCF-7細胞S期和G2M期細胞增加；25 μmol/L Gen 導致MCF-7細胞G2M期細胞增加；而100 μmol/L Gen處理后，G0G1期細胞增加，而S期和G2M期細胞減少；與對照組相比，100 μmol/L Gen導致MDA-MB-231細胞G0G1期細胞百分率提高，5 μmol/L和25 μmol/L Gen對細胞周期無明顯影響，見圖5、6。

圖7 Gen對MDA-MB-231細胞凋亡的影響Fig.7 Effect of Gen on apoptosis in MDA-MB-231 breast cancer cells

2.6雙染法檢測Gen對乳腺癌細胞凋亡的影響 當濃度≥25 μmol/L時，Gen對乳腺癌及乳腺上皮細胞生長增殖的抑制作用明顯，因此采用雙染法檢測細胞凋亡情況。結果表明，MCF-7和MDA-MB-231細胞在25 μmol/L Gen誘導后活細胞百分率差異無統計學意義，見圖7。

3 討論

流行病學調查顯示，乳腺癌的發病年齡持續降低，成為“最年輕”的癌癥[7]。本研究發現，不同濃度的Gen對受體分布不同的乳腺癌細胞產生的效應不同，低濃度(≤10 μmol/L)Gen促進乳腺癌細胞增殖，高濃度Gen抑制乳腺癌細胞增殖，與文獻[8]結論相同。細胞周期結果顯示，Gen對MCF-7的細胞周期具有推進作用。Lucki等[9]發現這種效應可能由酸性神經鞘氨醇酶基因(acid ceramidase，ASAH1)轉錄增加所導致，體外試驗證實低劑量(≤10 μmol/L)Gen作用下的MCF-7細胞增殖更迅速，尤其是培養體系中不存在雌激素時促進作用更加明顯。

Gen攝入對于ER+乳腺癌患者可能是不容忽視的危險因素。原花青素是一類廣泛存在于自然界的植物多酚，在水果、紅酒中大量存在，作為抗炎、抗腫瘤成分存在于日常飲食，可通過上調Caspase途徑誘導乳腺癌MCF-7細胞凋亡，通過促進FoxA1表達，誘導三陰性乳腺癌MDA-MB-231細胞凋亡，逆轉耐藥細胞株MCF-7/ADR的耐藥性[10]。在結腸癌、肝癌細胞中原花青素可通過PI3K/Akt途徑抑制腫瘤細胞增殖和促進凋亡。PB1是二聚體形式的原花青素亞型，Karabulut等[11]發現，PB1的抗炎作用主要通過下調MAPK通路及NF-κB通路的活性實現。Gen與PB1聯合作用實驗表明，PB1可下調受低濃度Gen刺激的MCF-7細胞中TSP50表達量，并且相關膜分子及細胞增殖實驗的結果也呈現相似抑制作用，可能通過MEK-Erk信號通路實現[12]。

MMP-2是基質金屬蛋白酶的成員，具有降解細胞外基質，促進腫瘤增生和轉移等作用，被認為是惡性腫瘤細胞侵襲和轉移的標志之一[13]，使用其上游分子MEK1/2抑制劑U0126對MZK-Erk信號通路進行阻斷，可觀察到該促進作用消失甚至逆轉，表明MEK-Erk信號通路可能是Gen促進MCF-7細胞增殖與轉移的重要路徑，NF-κB激活后可使腫瘤細胞無限制的增殖，利用基因敲除技術證明TSP50升高與NF-κB活化密切相關，而NF-κB也是MEK-Erk信號通路的下游分子之一，說明Gen可能通過該信號通路活化促進細胞增殖和轉移[14,15]。本研究中，Gen對TSP50的促進作用與Erk1/2磷酸化水平增加密切相關。

綜上所述，高劑量的Gen可抑制乳腺癌細胞的增殖，低濃度(≤10 μmol/L)的Gen可通過MEK/Erk信號通路上調乳腺癌細胞TSP50蛋白的表達，又能使乳腺癌干細胞表型特性分子增加，起到促進乳腺癌細胞增殖的作用；基于我國大眾飲食習慣，Gen等植物性雌激素對人體健康的影響應得到重視，尤其是對未成年人和絕經期婦女的潛在風險。