敲減CDKL5對人膠質母細胞瘤細胞表觀遺傳學的影響①

張驚宇 鄭永慧 初婷婷

(黑龍江省醫學科學院,哈爾濱 150081)

近期有研究發現CDKL5敲除鼠的運動協調性差、少動、視力差，驚厥處理時腦電圖異常，視覺誘發反應下調，這與雷特綜合征和自閉癥的表型相似[1]。敲除鼠的神經干細胞增殖更快，新生顆粒神經元凋亡水平更高，導致分化的成熟神經元減少，樹突嚴重萎縮，皮層更薄[2]。敲除CDKL5雖然抑制神經元的分化，卻不影響膠質細胞的分化[3]。敲除鼠腦中Akt、AMPK、PKC和MAKP信號通路受到影響，其中主要抑制Akt及下游mTOR、RSK和GSK-3β的磷酸化。抑制GSK-3β的活性可改善CDKL5敲除的神經干細胞向神經元分化的缺陷[4]。此外，在成纖維細胞中，CDKL5通過調控剪切調控蛋白的磷酸化狀態來控制核小斑的形態，核小斑能持續為活性轉錄位點提供剪切因子，且確定CDKL5影響選擇性剪切[5]。CDKL5還調控基因表達。在CDKL5突變的誘導型多能干細胞中，GluD1(glutamate D1 receptor)的表達下調。GluD1能誘導皮層神經元的抑制性突觸前分化，與神經疾病有關。 CDKL5的表達受到表觀遺傳學調控。神經系統中(腦紋狀體和前扣帶皮層、PC12細胞)MeCP2和DNA甲基轉移酶都抑制CDKL5的表達[6,7]，而MeCP2和Dnmt1正是CDKL5的激酶底物[8]。

1 材料與方法

1.1材料 細胞培養板購自美國corning公司；所有培養基及添加劑均購自美國Gibco公司；BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司；載體pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA購自紐恩生物科技公司；CDKL5(ab22453)購自Abcam公司；GAPDH購自Sigma-Aldrich公司；Dnmt1購自Cayman公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養 人膠質母細胞瘤細胞系U87添加1%非必需氨基酸和1%(1 mmol/L)丙酮酸鈉；所有細胞均置于37℃恒溫培養箱中培養，CO2濃度5%。

1.2.2質粒構建 構建CDKL5 shRNA所用的載體為pLKD-UBC-GFP-U6-shRNA。實驗涉及的shRNA序列為shCDKL5 R：5′-CCGGAGTGAGAGCTAAAG-GCATTTTCAAG-3′,F:5′-AGAAATGCCTTTAGCTCTCACTTTTTTTG-3′。干擾質粒和融合質粒委托紐恩生物技術公司包裝制成慢病毒顆粒濃縮液。

1.2.3mRNA提取和qPCR檢測 RNAiso試劑裂解U87細胞,氯仿抽提總RNA溶于無酶水(無DNA酶、無RNA酶)中,利用反轉錄試劑盒將RNA反轉錄為cDNA進行PCR。檢測的MeCP2，Dnmt1，GAPDH q-PCR引物序列來源于NCBI。

1.2.4蛋白免疫印跡 分別提取細胞蛋白和組織蛋白，BCA定量后進行蛋白免疫印跡檢測，上樣量為(45 μg/孔)。蛋白質經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后轉移到硝酸纖維素膜(NC膜)上(200 mA電流,室溫轉膜2 h),用含5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉2 h,將稀釋后的一抗稀釋液敷于膜上,4℃過夜。清洗一抗后,1∶1 000加入辣根過氧化物酶標記的抗鼠二抗,室溫孵育1 h,清洗二抗后,用ECL化學發光反應進行顯色。

1.3統計學處理 SPSS18.0軟件進行統計學處理，t檢驗分析組間差異。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1CDKL5在人膠質母細胞瘤細胞系U87中的表達情況 結果顯示，CDKL5在人膠質母細胞瘤細胞U87中高表達，通過shRNA敲減CDKL5后，其表達量顯著降低，表明敲減是有效的，為后續實驗提供基礎(圖1)。

2.2敲減CDKL5引起表觀遺傳標記物表達的改變 由于組蛋白修飾所調控的表觀遺傳學對于神經干細胞的分化具有重要作用，本研究檢測了膠質母細胞瘤細胞中組蛋白H3的修飾情況。結果顯示，敲減CDKL5引起mRNA(圖2A)和蛋白(圖2B)水平上的表觀遺傳因子Dnmt1的下調和MeCP2的上調。以上結果表明，CDKL5有助于維持膠質母細胞瘤細胞中的表觀遺傳學特征。

圖1 CDKL5在人膠質母細胞瘤細胞系U87中的表達Fig.1 CDKL5 protein expression in U87 cell lines

圖2 敲減CDKL5引起表觀遺傳標記物表達的改變Fig.2 Knockdown of CDKL5 induces expression changes of epigenetic markersNote:A.mRNA level,***.P<0.001;B.Protein expression level.

3 討論

本研究發現，敲減膠質母細胞瘤中的CDKL5改變多個表觀遺傳標志，包括組蛋白H3的賴氨酸修飾和Dnmt1、MeCP2的表達。異常的組蛋白賴氨酸甲基化與腫瘤的關系已很明確[9]。抑制IDH1突變體、Dnmt1、KDM1等表觀遺傳相關蛋白來回調異常的組蛋白賴氨酸甲基化和乙酰化能成功誘導膠質瘤細胞分化并抑制其生長[10-12]。在所有的組蛋白H3賴氨酸修飾中，H3K4me1/2/3、H3K9me1和H3K9ac與基因表達激活有關，而H3K9me2/3與基因沉默有關，因此，敲減CDKL5引起的H3K4me2、H3K9ac上調和H3K9me3下調或能重新激活抑癌基因的表達，同時沉默癌基因，誘導膠質瘤分化，從而降低膠質瘤的惡性程度[13]。

Dnmt1和 MeCP2都是CDKL5的激酶底物。其中Dnmt1是維持CpG島甲基化和組蛋白H3修飾模式的關鍵酶，參與有絲分裂、耐藥、自我更新等多種腫瘤相關事件[14]。Dnmt1能調控基因表達，而Dnmt1的表達也受到啟動子甲基化和賴氨酸甲基化依賴性蛋白穩定性的調控。CDKL5直接調控膠質瘤中表觀遺傳修飾的機制尚不清楚，我們推測可能部分與Dnmt1有關。CDKL5促進Dnmt1 N端(1-290aa)的磷酸化，但具體的磷酸化位點未知。此序列范圍內有三個重要的絲氨酸磷酸化位點，其中Akt磷酸化S127和S143位點，PKC磷酸化S127位點，CDK1/2/5磷酸化S154位。這幾個位點所在的小段區域與Dnmt1的活性有關，其中S127位磷酸化避免Dnmt1/PCNA/UHRF1復合物的形成，降低Dnmt1的甲基轉移酶活性和DNA整體甲基化，促進膠質瘤發展；S154位磷酸化主要促進Dnmt1的活性[15]，S143位磷酸化抑制相鄰K142位的SET7依賴性單甲基化，從而免受泛素-蛋白酶體降解。膠質母細胞瘤中存在CDKL5與Dnmt1的相互作用，理應存在Dnmt1的磷酸化修飾。敲減CDKL5也下調Dnmt1的mRNA水平，故其蛋白水平的下調應非S143磷酸化下調引起的蛋白降解所致。CDKL5無法調控Dnmt1的轉錄，其mRNA水平下調更可能歸因于整體表觀遺傳變化連帶引起的Dnmt1啟動子甲基化上調、對應組蛋白修飾變化或對應轉錄因子表達上調，而整體表觀遺傳變化是否由Dnmt1推動尚不知曉，需要深入研究。MeCP2通過結合甲基化的CpG島來抑制靶基因轉錄，MeCP2參與神經分化，而維甲酸不僅能上調MeCP2的表達，也能誘導膠質母細胞瘤C6細胞向神經元方向分化，表明MeCP2與膠質瘤分化有潛在聯系。敲減CDKL5引起Dnmt1的下調和MeCP2的上調結果表明，CDKL5可能參與維持膠質母細胞瘤細胞中的表觀遺傳學特征，為未來的研究提供了實驗基礎。