中藥復方腸復康膠囊通過VEGF/VEGFR2信號通路干預結腸癌血管生成實驗研究

夏 雨 李 濤 孫名揚

(北京大學人民醫院,北京 100000)

結腸癌(colorectal carcinoma，CRC)是發病率、轉移率、致死率較高的消化道惡性腫瘤之一[1]。近年來，隨著人們生活習慣和飲食結構的改變，CRC的發病率逐年上升[2]，由于CRC治療的高額費用，以及預后癌細胞的高轉移性，嚴重影響患者的生活質量[3]。研究表明，腫瘤血管新生與腫瘤的發生、發展以及腫瘤的侵襲轉移關系密切[4，5]，新生血管為腫瘤細胞提供營養支持和場所維系，是腫瘤細胞發生侵襲轉移中不可或缺的環節[6]。腫瘤血管新生已成為藥物治療腫瘤的靶向位點。血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是在生物形態學具有高度特異性的促血管內皮細胞生長的蛋白質分子，血管內皮生長因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR2)則是在腫瘤血管內皮表面與VEGF特異性結合的高親和力受體。VEGF/VEGFR2是調控腫瘤血管生成的關鍵信號通路[7]。腸復康(cerebiogen，CBG)膠囊是喜樹果、薏苡仁、莪術、鴉膽、人參等5味中藥組成的復方制劑，研究表明CBG在臨床上治療大腸癌療效確切，但機制尚不清楚[8]。本研究通過體外和體內實驗，探討CBG對CRC腫瘤血管生成中VEGF/VEGFR2信號通路的作用機制，為日后的臨床研究提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞和動物 高分化性的人結腸癌HT29細胞系、人體臍靜脈內皮HUVECs細胞來源于中科院細胞所。4～5周無特定病原體(specific pathogen free,SPF)級雄性BALB/c裸小鼠48只，體質量20～22 g，由北京大學實驗動物中心提供(許可證號2019-0005A)；室溫下標準飼料、自由飲水、分籠(4籠)適應性飼養1周后用于試驗，動物的使用及操作按照本院動物管理委員會的規定執行。

1.1.2實驗材料 CBG膠囊(成都中醫藥大學附屬醫院藥廠生產)；DAB試劑盒(美國Amresco公司)；Western blot試劑盒(Santa Cruz公司)；ELISA試劑盒(美國CST公司)；胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、胰蛋白酶、RPMI1640培養基、青霉素(penicillin,peillin G)和鏈霉素(streptomycin,STC)(美國Gibco公司)；兔抗人VEGF/VEGFR2、辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG(Abcam公司)；MTT試劑盒(美國Sigma公司)。

1.1.3主要儀器 倒置顯微鏡(Thermofisher)，E-Gel Imager凝膠成像儀(美國Beckma公司)，生物顯微鏡(德國徠卡公司)，Multiskan MK3酶標儀(美國Fermentas公司)。

1.2方法

1.2.1體外實驗

1.2.1.1細胞培養與體外實驗分組 從液氮中分別取出人結腸癌HT29和HUVECs細胞，37℃水浴溶解，加入含10%FBS、100 U/ml peillin G、100 μg/ml STC的RPIM1640培養基中，離心去上清，加入細胞培養液懸浮細胞，接種于培養瓶中，37℃，5%CO2培養，融合度達80%，采用0.25%的胰蛋白酶消化，采用完全培養基傳代。取對數生長期細胞用于試驗。將CBG溶解在標準PBS溶液里配置不同濃度的CBG溶液，用其處理人結腸癌HT29細胞并分為4組：對照組(細胞正常培養，添加標準PBS溶液)、CBG低劑量組(0.4 mmol/L)、CBG中劑量組(0.8 mmol/L)、CBG高劑量組(1.6 mmol/L)。

1.2.1.2顯微鏡下觀察各組HT29細胞形態變化 調整各組細胞濃度至1×104個/ml,接種于6孔板，37℃，5%CO2生化培養箱中繼續培養24 h后，置于生物顯微鏡下觀察細胞形態的改變。

1.2.1.3MTT法檢測細胞增殖能力 調整各組細胞濃度至3×104個/ml接種于96孔板中，37℃，5%CO2培養4 h，每孔加入MTT試劑10 μl，37℃孵育4 h，完全顯色后，用酶標儀在490 nm處檢測吸光值A值，細胞增殖率=(A陰性對照孔-A實驗孔)/A陰性對照孔×100%。

1.2.1.4Transwell小室實驗 實驗前12 h將培養基更換為無血清培養基，將40 μl Matrigel基質膠鋪于Transwell小室中，消化細胞并用1 μl PBS清洗 2遍，將500 μl 無血清培養基加入24孔板，取5×105個細胞重懸，向Transwell小室中加200～250 μl 細胞懸液，保證下層完全培養基與Transwell小室間無氣泡。置于培養箱內正常培養 24 h，加用甲醇配制、PBS 稀釋的0.1%結晶紫染液500 μl進行染色，室溫避光 15 min，PBS 漂洗后用棉棒擦Transwell小室內部，倒置晾干，置于倒置熒光顯微鏡下觀察穿過膜的細胞并拍照計數。

1.2.1.5小管形成實驗檢測各組HT29細胞的血管生成能力 將新鮮Matrigel溶膠平鋪于96孔培養板上，然后迅速轉移進37℃無菌培養箱，待Matrigel溶膠凝固后，將HUMCEs細胞以1×104個/ml接種于96孔板中，分組同1.2.1.1，分別加入含HT29細胞的培養上清液，繼續培養48 h，倒置光學顯微鏡下觀察HUMCEs的血管生成情況并拍照記錄。

1.2.1.6ELISA檢測各組HT29細胞VEGF、VEGFR2的表達 調整細胞濃度至1×104個/ml接種于24孔板中，分組同1.2.1.1，37℃，5%CO2生化培養箱中繼續培養24 h，ELISA試劑盒檢測各組細胞中VEGF和 VEGFR2的水平；每個樣本獨立重復測量3次。

1.2.2小鼠體內實驗

1.2.2.1裸鼠人結腸癌移植瘤模型 調整對數期HT29細胞濃度，制成1×107個/ml的細胞懸液。將健康BALB/c裸小鼠用碘酒、75%酒精消毒皮膚后，皮下注射2 ml細胞懸液到小鼠前肢腋下。注射后按壓數秒，3 d后，肉眼能觀察到米粒樣移植瘤證明模型構建成功。

1.2.2.2實驗分組 造模成功后，將48只實驗小鼠隨機分為4組，每組12只：CBG低劑量組、CBG中劑量組和CBG高劑量組分別灌胃4.5、9、18 g/kg的CBG，灌胃劑量0.3 ml，模型組灌胃等量生理鹽水，1次/d，所有小鼠均標準飼養。

1.2.2.3觀察裸鼠移植瘤 實驗28 d后，將各組小鼠脫頸椎處死，無菌解剖并剝離出完整腫瘤組織。稱量腫瘤質量，并比較各組小鼠的瘤體平均質量。

1.2.2.4各組小鼠腫瘤組織血管密度(microvessel density，MVD)測定 將50%腫瘤組織分別用10%的多聚甲醛固定，石蠟包埋并切片，用二甲苯和梯度乙醇脫蠟后置于檸檬酸鹽緩沖液中進行修復，以充分暴露抗原決定簇。然后用3%的雙氧水浸泡，室溫下孵育10 min，封閉，PBS沖洗3次，分別加稀釋好的CD34蛋白4℃過夜孵育，次日沖洗干凈，分別加入適量生物素標記的二抗室溫孵育30 min，清洗。加適量DAB顯色劑顯色，作用2～5 min，在顯微鏡下觀察到棕黃色顆粒后，用去離子水終止反應(注：DAB顯色劑須現用現配，避光保存)。蘇木素輕度復染2 min，清洗后于乙醇梯度脫水，二甲苯浸泡并干燥后用中性樹膠封片，鏡檢觀察并記錄實驗結果；用圖像分析系統分析圖像并計算微血管均數。

1.2.2.5蛋白免疫印跡Western blot法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR2蛋白的表達 按照常規提取目標蛋白樣品，使用BCA定量法檢測蛋白濃度，稀釋樣品，將待測樣品和Loading buffer混合，200 r/min輕微晃動以保證均勻混合，100℃沸水煮2 min，使蛋白質變性，然后加入到制備好的SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，每孔25 μl，電泳條件：電泳開始時電壓50 V 約15 min，分離膠100 V約2 h。結束后取出凝膠，4℃轉膜1.5 h，采用5%脫脂奶粉封閉PVDF膜2 h，加入一抗，4℃過夜，TBST洗膜后加入辣根過氧化物標記的羊抗兔IgG，37℃孵育2 h。加入ECL顯影，采用自動凝膠成像系統采集圖像，以GAPDH作為內參，分析蛋白水平。

1.3統計學分析 數據統計采用SPSS16.0軟件，作圖工具采用Graphpad5.01，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1各組HT29細胞形態學變化 如圖1示，溶劑對照組中HT29細胞貼壁細胞數量較多，生長旺盛，形狀規整，排列均一，細胞核質間隙清楚，細胞內容物均勻透明，細胞多成團狀生長，具有人結腸癌細胞HT29細胞的正常形態，培養液澄清；與溶劑對照組相比，CBG低、中、高劑量組細胞生長緩慢，視野內貼壁細胞數目明顯減少，細胞貼壁不牢固，細胞形態不完整，培養液中有較多漂浮的死細胞，并且隨CBG濃度的增加漂浮細胞數量明顯增加，細胞胞體皺縮嚴重，核濃縮明顯。

2.2CBG抑制HT29細胞的增殖 MTT檢測結果如圖2所示，與對照組比較，CBG低劑量組HT29細胞的增殖明顯受到抑制；與CBG低劑量組相比，CBG中劑量組HT29細胞增殖的抑制作用明顯增強；與CBG中劑量組比較，CBG高劑量組的HT29細胞增殖的抑制作用明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)，說明CBG抑制結腸癌HT29細胞的增殖隨其劑量的增大而增強。

2.3CBG抑制HT29細胞的侵襲 Transwell小室

圖1 顯微鏡觀察HT29細胞形態學變化(SP，×400)Fig.1 Morphological changes of HT29 cells (SP，×400)Note: A.Control group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.

檢測結果如圖3所示，與對照組比較，CBG低劑量組HT29細胞的侵襲能力明顯受到抑制；與CBG低劑量組相比，CBG中劑量組HT29細胞侵襲能力的抑制作用明顯增強；與CBG中劑量組比較，CBG高劑量組的HT29細胞侵襲能力的抑制作用明顯增強，差異有統計學意義(P<0.05)，說明CBG抑制結腸癌HT29細胞的侵襲隨其劑量的增大而增強。

2.4小管形成實驗檢測各組HT29細胞的血管生成能力 小管形成實驗結果如圖4所示，與對照組比較，CBG低劑量組中HUVECs細胞生成管狀結構數量明顯下降；與CBG低劑量組相比，CBG中劑量組HUVECs細胞生成管狀結構數量明顯下降；與CBG中劑量組比較，CBG高劑量組HUVECs細胞生成管狀結構數量明顯下降，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

2.5各組HT29細胞VEGF、VEGFR2的表達 ELISA檢測結果如圖5所示，與對照組相比，CBG低、中、高劑量組細胞中VEGF、VEGFR2的表達明顯下降，差異均有統計學意義(P<0.05)。

圖2 CBG抑制HT29細胞的增殖Fig.2 CBG inhibits proliferation of HT29 cellsNote: A.Control group；B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

圖3 CBG對HT29細胞的侵襲能力的影響(×200)

Fig.3 Effect of CBG on invasion ability of HT29 cells(×200)

Note： A.Control group；B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05; compared with C,△.P<0.05.

2.6各組小鼠成瘤瘤體平均質量比較 各組小鼠成瘤瘤體圖片如圖6所示，模型組小鼠腫瘤平均質量最大，而CBG低、中、高劑量組小鼠腫瘤平均質量均明顯低于模型組(P<0.05)，如圖7所示。

2.7各組小鼠腫瘤MVD比較 各組小鼠腫瘤組織MVD免疫組化如圖8示，MVD比較如圖9所示，與模型組相比，CBG組小鼠腫瘤組織MVD明顯減少，差異均具有統計學意義(P<0.05)，并且隨CBG劑量的增加，MVD減少明顯有劑量依賴性(P<0.05)。

圖4 小管生成實驗檢測HT29細胞的血管生成能力

Fig.4 Tubulogenesis test to detect angiogenesis ability of HT29 cells

Note： A.Control group；B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

圖5 ELISA檢測VEGF、VEGFR2的表達Fig.5 ELISA detected expression of VEGF and VEGFR2Note: A.Control group；B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

圖6 各組小鼠瘤體圖片(28 d)Fig.6 Tumor picture of mice in each group(28 d)Note: A.Model group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.

圖7 各組小鼠瘤體平均質量比較Fig.7 Comparison of average tumor mass of mice in each groupNote: A.Model group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

圖8 各組小鼠腫瘤組織MVD(免疫組化，SP×400)Fig.8 MVD of tumor in each group(Immunohisto-chemistry,SP×400)Note: A.Model group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.

圖9 各組小鼠MVD比較Fig.9 Comparison of MVD in each groupNote: A.Model group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

圖10 Western blot法檢測VEGF、VEGFR2蛋白的表達Fig.10 Western blot detection of expression of VEGF and VEGFR2 proteinNote: A.Model group;B.CBG low-dose group;C.CBG middle-dose group;D.CBG high-dose group.Compared with A,*.P<0.05;compared with B,#.P<0.05;compared with C,△.P<0.05.

2.8Western blot法檢測各組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR2蛋白的表達 蛋白免疫印跡檢測VEGF、VEGFR2蛋白表達，結果如圖10所示：與模型組相比，CBG低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)。

3 討論

目前，CRC的主要治療方法是手術、放療和化療[9]，但因上述方法具有潛在危害，以及CRC的高轉移性，致使CRC患者5年生存率比較低[10]。如何從根本上阻止癌細胞的生長，抑制腫瘤細胞的侵襲轉移是目前腫瘤治療中的研究熱點[11]。研究表明腫瘤血管的新生直接影響腫瘤的生長、增殖、侵襲和轉移[12]。因此尋找安全、高效的藥物抑制腫瘤血管的新生，在抗CRC治療中意義重大。

CBG在臨床上用來治療大腸癌效果明顯，但是其具體作用機制尚未完全明確[13]。有報道稱CBG能調控VEGF、MMP-2的表達，影響人結腸癌LoVo細胞裸鼠移植瘤血管的生成[14]。因此,本研究基于腫瘤細胞血管生成的角度，設計體外和體內實驗來研究CBG對高分化、高侵襲性結腸癌細胞HT29的作用機制。

首先用不同濃度CBG處理HT29，顯微鏡下發現HT29細胞隨CBG濃度的變化發生不同程度的改變；MTT實驗結果發現CBG能明顯抑制HT29的增殖；而體外小管生成實驗結果表明HUVECs細胞生成管狀結構數量隨CBG濃度的增加而明顯下降(P<0.05)；說明CBG能夠體外抑制HT29增殖，抑制腫瘤新生血管生成，這種抑制作用可能與VEGF/VEGFR2信號通路有關。為進一步研究CBG對CRC腫瘤中血管生成的作用，本研究中構建小鼠人結腸癌HT29細胞裸鼠移植瘤模型，實驗中設立模型組和Sham組，同時以不同劑量CBG灌服實驗小鼠，治療28 d后，處死小鼠。取出小鼠腫瘤組織，發現模型組中瘤體質量最大，而CBG高劑量組瘤體質量最小 (P<0.05)。腫瘤的MVD可以直觀反映腫瘤血管的生成，CD31、CD34是鑒定MVD的重要標志蛋白。本研究中以CD34為標記，進行免疫組化，與模型組相比，CBG組小鼠腫瘤組織MVD明顯減少，差異均具有統計學意義(P<0.05)，并且隨CBG劑量的增加，MVD減少有明顯劑量依賴性。說明CBG可抑制CRC裸鼠的血管生成。

腫瘤血管的生成是一個多種生化因子參與、步驟復雜的生化過程[15]。在正常生理狀態下，機體內的VEGF和VEGFR2處于相對平衡的狀態，血管基本不生長[16]；但是在腫瘤組織中，由于微環境的改變，腫瘤細胞內VEGF大量表達，從而開啟“血管生成開關”，VEGFR2則是在血管內皮中直接參與腫瘤血管的生成[17，18]。本研究中體外ELISA檢測結果表明，與A組相比，B、C、D組細胞中VEGF、VEGFR2的表達明顯下降 (P<0.05)；這與小管生成實驗中新生管狀結構的數量變化一致。而Western blot實驗結果表明，與模型組相比，CBG低、中、高劑量組小鼠腫瘤組織中VEGF、VEGFR2蛋白的表達水平明顯降低，差異均具有統計學意義(P<0.05)；這一變化趨勢與MVD變化趨勢一致。說明CBG能通過調控VEGF、VEGFR2蛋白的表達來影響腫瘤新生血管的生成。

本研究證明中藥復方腸復康可抑制HT29細胞增殖，抑制HT29細胞體外生成血管的能力，并且抑制人結腸癌HT29細胞裸鼠移植瘤模型中腫瘤血管的新生，其中的作用機制可能與VEGF/VEGFR2信號通路有關，但是如何將中藥復方腸復康應用于人結腸癌的靶向治療，還有待進一步的深入研究。