lncRNA GAS5通過抑制MAPK/ERK信號通路阻斷乳腺癌細胞的上皮-間質轉化過程

李 娟 高青山 牟成金 何 力

(四川省人民醫院東院乳腺甲狀腺外科，成都 610000)

在女性的惡性腫瘤致死率排名中，乳腺癌始終占據第一位，嚴重地威脅著女性的生命健康[1]。盡管隨著標準化化療和手術的廣泛應用，早期乳腺癌的死亡率已有顯著下降，但由于耐藥和遠處轉移的發生，乳腺癌死亡人數仍在上升[2]。約90%的乳腺癌死亡都是由遠處轉移引起的[3]。

人類全基因組測序分析結果表明，絕大多數基因組被轉錄為非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)，主要包括微小RNA(miRNA)和長非編碼RNA(lncRNA)[4]。通常將lncRNA定義為轉錄物長度超過200個核苷酸，且無蛋白編碼能力的RNA[5]。越來越多的證據表明lncRNA涉及各種病理生理學過程，如基因表達、細胞增殖、凋亡等[6]。更重要的是，lncRNA作為致癌基因或抗癌基因參與許多惡性腫瘤的發病和發展[7]。

生長抑制特異性轉錄本5(growth arrest special 5,GAS5)位于染色體的1q25，最早是使用從小鼠NIH 3T3細胞中提取的一種lncRNA[8]。一些研究表明GAS5作為腫瘤抑制因子在多種癌癥表達，如宮頸癌、前列腺癌和肺癌等[9-11]。在乳腺癌中GAS5下調并能抑制上皮-間質轉化[12]。但其在乳腺癌中的作用機制卻不明了，本研究擬深入探討GAS5對乳腺癌細胞惡性生物學行為的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1標本和細胞系 選取2017年1月1日至2018年1月1日我院乳腺外科收治的50例乳腺癌患者腫瘤組織及相鄰的非腫瘤組織。將組織樣品分成兩份，一份用10%福爾馬林固定用于組織病理學診斷，另一份立即在液氮中快速冷凍，并儲存在液氮中直至RNA提取。手術前未接受過放療或化療。所有實驗組織標本的使用我院倫理委員會批準。

1.1.2細胞株與主要試劑 人乳腺癌細胞系SKBR3、MCF-7和MDA-MB-231，以及正常乳腺上皮細胞系MCF-10A均購自復旦大學典型培養物保藏中心。胎牛血清，RPMI1640培養基均購自美國Gibco公司。Transwell小室購自美國Millipore公司。Matrigel購自美國BD公司。GAS5質粒及對照購自上海吉凱制藥技術有限公司。Lipofecta-mine2000轉染試劑購自日本TaKaRa公司。逆轉錄試劑盒(FSQ-101)購自日本ToYoBo公司，PCR試劑盒購自美國Sigma公司。裸鼠購自我院實驗動物中心。

1.2方法

1.2.1細胞培養和轉染 細胞在含10%胎牛血清的Dulbecco′s改良的DMEM培養基/高葡萄糖中培養。細胞在加有5%CO2的37℃潮濕培養箱中培養。使用Lipofectamine 2000用pcDNA-GAS5及對照vector轉染細胞。NC組為轉染對照組慢病毒組，OE-GAS5組為轉染si-GAS5慢病毒組；pcDNA-GAS5的核苷酸序列是正向5′-GGCGAGGAGTCGAGATGCGA-GAT-3′，反向5′-AATGCGAGGGAATCCTAT-CGAAA-TC-3′。轉染后，收獲細胞進行qRT-PCR分析。

1.2.2RNA提取和qRT-PCR分析 使用TRIzol試劑從組織或細胞中分離總RNA，并按照說明書用逆轉錄酶和寡核苷酸(dT)合成cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進行實時PCR，條件如下：94℃10 s，94℃5 s，52℃30 s退火，72℃15 s，40個循環。本實驗使用GAS5的特異性引物(正向引物，5′-ATCCGCAAGCCAGGAAGAGTC-3′和反向引物5′-CTTGCTTGATGCTTTGGTCTGT-3′)作為對照，用特異性引物(正向引物5′-CATCACCATCTTCCAG-GAGCG-3′和反向引物5′-TGACCTTGCCCACAGC-CTT-3′)擴增。

1.2.3細胞遷移能力測定 乳腺癌MDA-MB-231細胞在12孔塑料培養皿中生長至匯合，并用pcDNA-GAS5或NC處理。轉染24 h后，用 200 μl 移液器尖端在匯合的細胞單層上產生線性刮傷(一式三份)。為了在創傷之前從細胞周期中除去細胞，將細胞維持在無血清培養基中。在0 h和48 h拍攝圖像，觀察遷移的細胞和傷口愈合，實驗重復3次。

1.2.4細胞侵襲能力測定 將乳腺癌MDA-MB-231細胞按照上述方法轉染24 h后，將無血清培養基中的1×105個細胞接種在Transwell遷移室中。Transwell的上室用基質膠涂覆。含有20%FBS的培養基加入到下室中。24 h后，用棉絨除去未侵入的細胞。位于小室下表面的侵襲性細胞用結晶紫染色，然后用顯微鏡計數并統計。實驗重復3次。

1.2.5Western blot 根據蛋白相對分子質量大小，配制凝膠，根據所測蛋白濃度適量加入蛋白樣品及每孔5 μl的蛋白marker；跑膠，首先加壓80 V，保證所有樣品在同一水平線，待樣品至分離膠處，將電壓加到120 V；切膠，根據所需條帶大小，對照蛋白Marker進行切膠，并準備與所切膠條相同大小濾紙2片和PVDF膜(浸泡甲醇15 s)；按照濾紙、膠、PVDF膜、濾紙的順序排好，并趕出氣泡，壓緊，在250 mA恒流下，按1 kD蛋白1 min進行轉膜；轉膜結束后，PBST洗膜1次，并放入脫脂奶粉封閉1 h;一抗，PBST洗膜1次，將膜浸入稀釋好的一抗中，4℃過夜；二抗，PBST洗膜3次，將膜浸入稀釋好的二抗中，常溫下孵育1 h；顯影，PBST洗膜3次后，在暗室中曝光，并分析。

1.2.6裸鼠腫瘤異種移植模型 將1×106濃度的pcDNA-GAS5組和對照空載體組MDA-MB-231細胞分別注射到4～6周齡裸鼠的腋窩。飼養8周后檢測裸鼠腫瘤異種移植物的體積和質量生長情況。異體移植物大小根據以下公式測量：體積=1/2(最短直徑)2×最長直徑。

2 結果

2.1lncRNA GAS5在乳腺癌組織中和細胞系中的表達 通過qPCR比較lncRNA GAS5在30對乳腺癌和癌旁非腫瘤組織中的表達差異，結果如圖1所示，lncRNA GAS5在乳腺癌組織中的表達顯著低于癌旁正常組織(P=0.004)。比較lncRNA GAS5在正常乳腺上皮細胞系(MCF-10A)和三個乳腺癌細胞系(SKBR3、MCF-7和MDA-MB-231)中的表達，結果顯示lncRNA GAS5在乳腺癌細胞系中的表達顯著低于正常乳腺上皮細胞系，且在MDA-MB-231中的表達最低(圖2)，說明lncRNA GAS5在乳腺癌中可能是作為一個抑癌基因，因此選取MDA-MB-231細胞系進行后續的功能表型驗證。

2.2lncRNA GAS5與乳腺癌患者臨床病理參數之間的關系 在不同年齡段的乳腺癌患者之間GAS5的表達水平差異無統計學意義(P>0.05，表1)。隨著乳腺癌分期越高，乳腺癌患者組織中的GAS5的表達水平越高，存在乳腺癌淋巴結轉移的患者組織中GAS5的表達越明顯，差異具有統計學意義(P<0.05，表1)。

2.3lncRNA GAS5對乳腺癌細胞侵襲的影響

圖1 lncRNA GAS5在乳腺癌組織和癌旁正常組織的表達Fig.1 Expression of lncRNA GAS5 in breast cancer tissue cell lines

Transwell結果如圖3所示，pcDNA-GAS5組的細胞顯著少于對照空載體組(169.2±18.6 vs 103.7±16.1，P<0.05)，lncRNA GAS5的過表達顯著削弱了MDA-MB-231細胞的侵襲能力。

2.4lncRNA GAS5對乳腺癌細胞遷移的影響 劃痕愈合實驗檢測lncRNA GAS5對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響。如圖4所示，pcDNA-GAS5組的細胞愈合率較對照組顯著降低[(41.2±2.7)% vs (11.9±0.5)%，P<0.05]，lncRNA GAS5的過表達顯著降低了MDA-MB-231細胞的遷移能力。

2.5lncRNA GAS5對EMT過程的影響 檢測EMT重要標記物，包括上皮標記物E-cadherin和間質標志物N-cadherin、Vimentin和Snail。結果如圖5所示，lncRNA GAS5的過表達使MDA-MB-231細胞中的E-cadherin蛋白顯著升高， 而N-cadherin、Vimentin

圖2 lncRNA GAS5在正常乳腺上皮細胞系和乳腺癌細胞系中的表達Fig.2 Expression of lncRNA GAS5 in normal breast epithelial cell line and breast cancer cell linesNote:*.P<0.05.

表1 乳腺癌患者組織中GAS5的表達與其臨床病理特征之間的關系

Tab.1 Relationship between expression of GAS5 and clinicopathological features in tissues of patients with breast cancer

Clinicopathological datanHigh expression of GAS5Low expression of GAS5P valueAge(year)0.624≤602818106022157Pathological staging0.015Ⅰ817Ⅱ1459Ⅲ21516Ⅳ716Lymph node metastasis0.026No34727Yes16511

圖3 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細胞侵襲能力的影響Fig.3 Effect of lncRNA GAS5 on invasive ability of MDA-MB-231 cellsNote:*.P<0.05.

圖4 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of lncRNA GAS5 on migration ability of MDA-MB-231 cellsNote:*.P<0.05.

圖5 lncRNA GAS5對MDA-MB-231細胞E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail蛋白的影響Fig.5 Effect of lncRNA GAS5 on protein expression of E-cadherin,N-cadherin,Vimentin and Snail in MDA-MB-231 cells

圖6 lncRNA GAS5通過抑制MAPK/ERK蛋白信號通路影響細胞EMT過程Fig.6 lncRNA GAS5 influences cellular EMT process by inhibiting MAPK/ERK protein signaling pathway

和Snail蛋白的表達顯著降低。Western blot結果表明lncRNA GAS5可能會通過調節EMT從而影響MDA-MB-231細胞遷移和侵襲。

圖7 lncRNA GAS5對乳腺癌細胞裸鼠成瘤的影響Fig.7 Effect of lncRNA GAS5 on tumorigenicity of breast cancer cells in nude mice

2.6lncRNA GAS5通過激活MAPK/ERK蛋白信號通路影響細胞的增長和EMT過程 使用Western blot檢測總的ERK1/2蛋白和磷酸化的ERK1/2蛋白(P-ERK1/2)的表達情況，結果與預期的相似(圖6)，lncRNA GAS5的過表達顯著降低了MDA-MB-231細胞中P-ERK1/2的表達。通過MAPK/ERK信號通路的抑制劑—U0126進一步驗證，結果表明，U0126能消除lncRNA GAS5對P-ERK1/2蛋白表達的影響，在過表達lncRNA GAS5的MDA-MB-231細胞中加入U0126后，其P-ERK1/2的蛋白表達與對照組無明顯差異，而且EMT相關蛋白E-cadherin、N-cadherin、Vimentin和Snail均無明顯差異。

2.7lncRNA GAS5對乳腺癌細胞裸鼠成瘤的影響 通過體內裸鼠成瘤實驗驗證lncRNA GAS5的抑癌作用，結果如圖7所示，過表達lncRNA GAS5組的瘤體較對照組明顯縮小，而且隨著時間延長，過表達lncRNA GAS5組瘤體的體積也顯著小于對照組。在3周后，過表達lncRNA GAS5組腫瘤的重量較對照組明顯減輕[(0.37±0.09)g vs (0.82±0.10)g，P<0.05]，結果說明lncRNA GAS5抑制了裸鼠體內腫瘤的增長。

3 討論

在全球范圍內，乳腺癌的發病率呈增加的趨勢，每年約有130萬婦女患乳腺癌，乳腺癌占所有惡性腫瘤總數的7%～8%[13]。越來越多的證據證明lncRNA參與了乳腺癌的形成、進展和轉移[14]。與正常乳腺組織相比，許多lncRNA在乳腺癌組織中的表達不盡相同。Xu等最近的一項研究表明，lncRNA MALAT-1在乳腺癌細胞系中下調，并通過PI3K-AKT信號通路影響腫瘤細胞的轉移[15]。lncRNA CCAT1的上調與乳腺癌患者的疾病進展和預后不良密切相關[16]。在乳腺癌中，lncRNA UCA1通過與miR-143相互作用調節細胞生長和凋亡[14]。

GAS5包括12個外顯子，它能剪接成兩個成熟的lncRNAs[17]。最近，Cao等[18]發現GAS5的過表達促進膀胱癌耐藥細胞株的凋亡。在卵巢癌中，GAS5在腫瘤組織中減少并且低表達的GAS5往往預后更差[19]。此外，GAS5的過度表達通過調節細胞周期蛋白D1，p21和凋亡蛋白酶活化因子1抑制卵巢癌細胞的增殖[20]。宮頸癌細胞中GAS5下調促進細胞的增殖、遷移和侵襲[21]。結果顯示lncRNA GAS5在乳腺癌中表達明顯低于正常組織，而且lncRNA GAS5的過表達能顯著影響MDA-MB-231細胞的侵襲和遷移。動物實驗同樣證實lncRNA GAS5能抑制腫瘤在裸鼠體內的生長。以上結果說明lncRNA GAS5在腫瘤中可能作為潛在的抑癌基因。

EMT是導致腫瘤轉移的重要原因之一，主要涉及上皮表型的喪失和間質及遷移表型的獲取[22]。Wnt、TGF-β、Hedgehog、Notch、NF-κB及MAPK/ERK被認為是參與EMT過程的關鍵分子[23]。研究中發現上調lncRNA GAS5表達導致上皮標志物E-cadherin的顯著增加，而間充質標志物N-cadherin、Vimentin和Snail明顯減少，表明lncRNA GAS5可能是乳腺癌細胞發生EMT的關鍵調控因子。但是，由于在發生EMT過程中可能存在許多共同的作用位點，所以我們需要探究lncRNA GAS5在乳腺癌細胞中調控EMT的潛在機制。

MAPK/Erk信號通路是在腫瘤發生中重要的細胞信號傳導網絡之一[24]。lncRNAs異常激活磷酸化Erk1/2在許多類型的癌癥中都有被發現[25]。有研究顯示，MAPK/ERK途徑的過度激活促進了EMT的進展[26]。而在膠質瘤細胞中，通過抑制MAPK/ERK能顯著削弱其遷移和侵襲能力[27]。本研究結果表明，lncRNA GAS5的過表達顯著降低了MDA-MB-231細胞中P-ERK1/2的表達。而當使用選擇性磷酸化ERK1/2抑制劑U0126時，lncRNA GAS5對MDA-MB-231細胞的P-ERK1/2和EMT相關蛋白的影響被抵消。

綜上所述，lncRNA GAS5可能通過抑制MAPK/ERK信號通路，阻斷乳腺癌細胞的EMT過程。lncRNA GAS5可能成為乳腺癌診斷和治療的新的靶點。