MDC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞遷移、侵襲與凋亡的影響

高 翔 肖獻(xiàn)花 劉永軍 鄭 磊 李貴梅 于 華

(邯鄲市第一醫(yī)院，邯鄲 056000)

卵巢癌是女性惡性腫瘤中較為常見(jiàn)的疾病，發(fā)病率高，死亡率高，易轉(zhuǎn)移侵襲，患者預(yù)后較差。目前細(xì)胞減滅術(shù)與放化療在一定程度上可以減輕腫瘤負(fù)荷，但不能明顯改善患者的遠(yuǎn)期生存情況，歸因于卵巢癌進(jìn)展過(guò)程中具體的分子生物學(xué)作用機(jī)制尚未明確[1]。卵巢癌早期篩查的關(guān)鍵分子可能作為新型標(biāo)志物有助于指導(dǎo)治療的臨床效果，提示患者預(yù)后。在卵巢癌中DNA損傷修復(fù)相關(guān)基因MDC1 (mediator of DNA damage checkpoint protein 1)作為潛在的原癌基因被報(bào)道，通過(guò)誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化促進(jìn)卵巢癌轉(zhuǎn)移[2]。MDC1是參與DNA損傷修復(fù)(是指DNA受到損傷后機(jī)體自發(fā)地進(jìn)行相應(yīng)的修復(fù)機(jī)制)的重要分子[3]。目前，MDC1在卵巢癌進(jìn)展中的作用機(jī)制研究較少[4]，本研究基于卵巢癌的臨床病理和基因分子特點(diǎn)，旨在研究卵巢癌進(jìn)展的目標(biāo)分子MDC1對(duì)卵巢癌進(jìn)展的影響及其作用機(jī)制?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 選取我院2015年8月～2016年10月收治的80例卵巢癌患者，全部患者經(jīng)病理確診，年齡54～68歲，平均(56.3±1.2)歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合WHO卵巢癌診斷標(biāo)準(zhǔn)并分類(lèi)；②納入研究前未使用激素藥物，或影響檢測(cè)結(jié)果的藥物；③接受定期隨訪與評(píng)估疾病預(yù)后者；④本次研究經(jīng)患者同意并簽署知情同意書(shū)。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并甲狀腺激素異常者；②合并庫(kù)欣綜合征及其他內(nèi)分泌疾病者；③其他腫瘤疾病者。

1.1.2細(xì)胞及主要試劑 細(xì)胞系人卵巢HO8910 PM，購(gòu)于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏細(xì)胞庫(kù)，經(jīng)轉(zhuǎn)染MDC1干擾載體pGIPZ-shMDC1及空載體pGIPZ-NC-backbone(美國(guó)Open Biosystems公司)，命名為shMDC1-HO8910PM、NC(空白對(duì)照)-HO8910PM。購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich的MDC1小干擾RNA (siR NA)序列為：negative control (5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3′)，siRNA2 (5′-CUCAUUGCUCCAUUCCACUdTdT-3′)，siRNA3 (5′-GAAGAUCUUCCAUGGAGUAdTdT-3′)；常規(guī)胰酶(上海生工公司)；一抗(美國(guó)Gene Tex公司)；二抗(英國(guó)Jastesm公司)；MDC1抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；染色液購(gòu)自北京索萊寶生物公司；FBS培養(yǎng)基、碘化丙啶、蘇木素、噻唑蘭(MTT)等試劑購(gòu)自中國(guó)聯(lián)科生物公司。

1.2方法

1.2.1siRNA干擾的轉(zhuǎn)染 控制第2天的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞密度為30%～50%，若第2天生長(zhǎng)良好則進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)移7.5 μl Lipofectamine RNAiMAX和20 μmol/L siRNA液在100 μl的Opti-MEM稀釋后靜置5 min，待混勻后再靜置20 min。使用鋪板細(xì)胞PBS洗2次，加入1.8 ml培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)染混合物；繼續(xù)孵育4～6 h去除轉(zhuǎn)染復(fù)合物，在轉(zhuǎn)染24～72 h后(24 h檢測(cè)RNA水平，48 h檢測(cè)蛋白水平)，檢測(cè)siRNA干擾效率并進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT試驗(yàn) 選取對(duì)數(shù)期細(xì)胞，常規(guī)胰酶消化細(xì)胞并計(jì)數(shù)，細(xì)胞鋪于96孔板，接種密度1 000～3 000個(gè)/孔，邊孔用無(wú)菌PBS填充；5% CO237℃孵育，至單層細(xì)胞鋪滿(mǎn)孔底(細(xì)胞貼壁后即可加藥)，加入濃度梯度的藥物。每個(gè)孔中添加噻唑蘭(MTT)試劑，繼續(xù)孵育≥4 h。采用空針去除孔內(nèi)液體，避免吸入結(jié)晶沉淀物，注意避光操作，利用檢測(cè)儀測(cè)定吸光度值。

1.2.3Matrigel侵襲實(shí)驗(yàn) 按照1∶6稀釋Matrigel和無(wú)血清培養(yǎng)液，Transwell小室中每孔轉(zhuǎn)移15 μl，37℃靜置1 h。HO8910PM細(xì)胞轉(zhuǎn)染24 h后，1 000 r/min離心1 min，去上清，加入無(wú)血清培養(yǎng)液及3×105個(gè)細(xì)胞，達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)稀釋至400 μl，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。將600 μl含10% 胎牛血清(FBS)的DMEM培養(yǎng)液加入小室，繼續(xù)在CO2恒溫箱中培養(yǎng)24 h。去掉嵌室內(nèi)液，PBS洗3次，90%乙醇固定30 min，0.1%結(jié)晶紫染色30 min，風(fēng)干后，顯微鏡拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.4細(xì)胞劃痕法實(shí)驗(yàn) 接種以上細(xì)胞待鋪滿(mǎn)培養(yǎng)板80%時(shí)，轉(zhuǎn)染6 h后換液，直至鋪滿(mǎn)整個(gè)培養(yǎng)板，使用200 μl槍頭劃痕，用PBS沖洗5次去除殘留細(xì)胞，以0 h為劃痕時(shí)間點(diǎn)，每隔24 h拍照記錄。

1.2.5免疫組織化學(xué)染色 依次按照如下步驟進(jìn)行：組織切片脫蠟→抗原修復(fù)→去除過(guò)氧化物酶→封閉血清→孵育→顯色→避光蘇木素復(fù)染→脫水→蓋玻片封片。由2位病理科醫(yī)生進(jìn)行評(píng)分[5]，包括4級(jí)，0級(jí)為未出現(xiàn)染色，或者<5%細(xì)胞呈現(xiàn)染色；1級(jí)為低強(qiáng)度染色，或者5%～20% 染色細(xì)胞；2級(jí)為中度強(qiáng)度染色，或者21%～50%染色陽(yáng)性；3級(jí)為強(qiáng)染色，或者>50%染色陽(yáng)性。將MDC1表達(dá)水平分為2組：MDC1高表達(dá)組(3級(jí)染色強(qiáng)度)與MDC1低表達(dá)組(0～2級(jí)染色強(qiáng)度)。

1.2.6細(xì)胞周期與凋亡分析 轉(zhuǎn)染siRNA干擾以上細(xì)胞的目的基因24 h后，用胰酶消化細(xì)胞并用10% FBS培養(yǎng)基終止消化后經(jīng)800 r/min離心5 min，棄液后用PBS沉淀離心，避光碘化丙啶染色30 min。用300 目濾網(wǎng)濾至流式上樣管，依據(jù)細(xì)胞形態(tài)調(diào)整條件上機(jī)檢測(cè)，最后利用流式細(xì)胞儀采用Multicycle軟件分析細(xì)胞周期與凋亡情況。

2 結(jié)果

2.1MDC1表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析 免疫組化結(jié)果顯示卵巢癌中MDC1表達(dá)集中在細(xì)胞核部位，為核蛋白(圖1)。圖1A～C分別為MDC1典型特異性染色強(qiáng)度強(qiáng)、中、弱，MDC1表達(dá)集中于細(xì)胞核部位，為核蛋白；圖1D為Kaplan-Meier生存分析，結(jié)果表明MDC1高表達(dá)組預(yù)后差(P<0.05)。兩組患者FIGO分期、組織學(xué)分類(lèi)、血清CA125及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移存在相關(guān)性(P<0.05)，而年齡無(wú)相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 80例卵巢癌石蠟組織切片的免疫組化染色Fig.1 Immunohistochemical staining of paraffin sections of 80 ovarian cancer tissuesNote: A-C.Immunohistochemical staining of paraffin sections of ovarian cancer (immunofluorescence,×20);D.The result of high and low expression of MDC1 in Kaplan-Meier survival analysis.

表1 MDC1表達(dá)與卵巢癌臨床病理學(xué)特征相關(guān)性分析[n(%)]

Tab.1 Correlation analysis between MDC1 expression and clinicopathological features of ovarian cancer[n(%)]

Relevant factorsnMDC1 low expressionMDC1 high expressionχ2 valueP valueAge(year)<60309210.0350.852≥60501634Clinical stageⅠ-Ⅱ stage2414128.4340.004Ⅲ-Ⅳ stage56479Histological classificationSlurry554698.8860.003Non-slurry251312Serum CA125<35102834.1280.000≥3570655Lymph node metastasisNegative2071318.8080.000Positive60519

圖2 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC1對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的影響Fig.2 Transwell assay to examine effect of MDC1 on cell migration and invasion

圖3 MDC1 siRNA干擾后對(duì)細(xì)胞遷移侵襲能力的影響Fig.3 Effect of MDC1 siRNA interference on cell migration and invasion ability

圖4 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)MDC1干擾后對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響Fig.4 Effect of scratch test on cell migration ability after MDC1 interference

GroupsG0G1G2MSNC-HO8910PM47.55±2.4122.34±0.4930.11±2.14shMDC1-HO8910PM82.88±2.188.52±1.388.60±1.72t value18.83116.34613.570P value0.0000.0000.000

2.2MDC1對(duì)卵巢癌細(xì)跑的遷移和侵襲的影響 Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MDC1干擾細(xì)胞系shMDC1-HO8910PM穿入下室的細(xì)胞數(shù)明顯較NC-HO8910-PM減少(P<0.05，圖2)，同時(shí)siRNA干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果也進(jìn)一步證明以上結(jié)果(圖3)。劃痕實(shí)驗(yàn)也顯示，shMDC1-HO8910PM的遷移能力弱于NC-HO8910 PM(P<0.05，圖4)。

2.3MDC1對(duì)卵巢癌細(xì)胞的周期與凋亡的影響 siRNA干擾MDC1 24 h后，發(fā)現(xiàn)與NC-HO8910PM比較，細(xì)胞周期G0G1細(xì)胞比例明顯增加，G2M、S細(xì)胞比例明顯減少(P<0.05)，提示MDC1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的進(jìn)展,見(jiàn)表2。

3 討論

近年來(lái)，隨著腫瘤生物學(xué)研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)DNA損傷修復(fù)作為機(jī)體早期抵抗腫瘤過(guò)程的關(guān)鍵防線，而經(jīng)典的抑癌基因參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程[6]。若DNA損傷后不能進(jìn)行有效的修復(fù)，則DNA遺傳穩(wěn)定性改變而導(dǎo)致基因突變形成腫瘤。臨床上主要通過(guò)放化療治療手段損傷腫瘤細(xì)胞DNA來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤治療[7]。

近年來(lái)，MDC1被陸續(xù)發(fā)現(xiàn)參與腫瘤的進(jìn)展。有研究指出MDC1參與胃癌細(xì)胞增殖和周期調(diào)控，揭示其可作為食管癌的一個(gè)潛在基因靶點(diǎn)[8]。而Qin等[9]研究表明MDC1影響胃癌的進(jìn)展過(guò)程。此外，MDC1在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過(guò)程也發(fā)揮同樣的作用。本課題組前期通過(guò)分析上皮性卵巢癌的不同蛋白質(zhì)組學(xué)及其表達(dá)差異，以及與正常卵巢組織對(duì)比分析，發(fā)現(xiàn)MDC1參與DNA損傷修復(fù)過(guò)程，故推測(cè)其可能影響腫瘤的進(jìn)展。雖然在不同腫瘤中MDC1的作用機(jī)制不同，但以上研究進(jìn)一步揭示MDC1可能在卵巢癌進(jìn)展過(guò)程發(fā)揮類(lèi)似的調(diào)控機(jī)制[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，shMDC1-HO8910PM與siRNA干擾后的實(shí)驗(yàn)均說(shuō)明MDC1基因敲減后導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲能力明顯減弱。而劃痕實(shí)驗(yàn)也表明MDC1促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移能力，以上均揭示在卵巢癌中MDC1能促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞遷移侵襲，這為臨床卵巢癌治療提供可靠的信息。此外，在宮頸癌和食道癌的研究中，MDC1對(duì)細(xì)胞周期和耐藥性有影響，但在卵巢癌中，siRNA干擾MDC1后，細(xì)胞周期G0G1細(xì)胞比例明顯增加，G2M、S細(xì)胞比例明顯減少，提示MDC1促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的進(jìn)展。

為了進(jìn)一步研究MDC1在卵巢癌中的表達(dá)位置，本研究采用免疫組織化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)MDC1主要集中在細(xì)胞核部位，這也與部分研究資料證實(shí)的MDC1通過(guò)與其他蛋白相互作用來(lái)進(jìn)行DNA損傷修復(fù)是一致的[11,12]。原發(fā)性卵巢癌多采用鉑類(lèi)藥物，但在治療中發(fā)現(xiàn)較多患者出現(xiàn)復(fù)發(fā)或耐藥性。目前，研究者深入探究卵巢癌鉑類(lèi)藥物耐藥機(jī)制去改善患者預(yù)后[13,14]。通過(guò)Kaplan-Meier生存分析發(fā)現(xiàn)MDC1表達(dá)與卵巢癌FIGO分期、組織學(xué)分類(lèi)、血清CA125及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素均有相關(guān)性，高表達(dá)提示預(yù)后差，但與發(fā)病年齡無(wú)關(guān)。故MDC1可作為分析卵巢癌預(yù)后的分子標(biāo)志物[15]。

綜上所述，MDC1的表達(dá)水平可能與卵巢癌預(yù)后相關(guān)，其高表達(dá)提示預(yù)后差，同時(shí)MDC1具有促進(jìn)卵巢癌遷移侵襲作用，并促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的進(jìn)展。需要指出的是，MDC1對(duì)卵巢癌進(jìn)展的機(jī)制還有待于更多的基礎(chǔ)與臨床研究去證實(shí)。