化學發光法在丙烯酰胺測定中的應用探討

吳升紅

(安徽糧食工程職業學院，安徽 合肥 230011)

丙烯酰胺，簡稱AM，是一種小分子白色晶體，被廣泛應用于紡織、污水處理及凈化、冶金化工等多個領域，復合體的丙烯酰胺并沒有毒性，但是單體形式存在的丙烯酰胺具有很強的毒性.眾多科學家通過大量的動物實驗證實丙烯酰胺具有神經毒性、遺傳毒性以及生殖等毒性，此外還會引起基因突變以及造成染色體異常，誘發癌癥，國際癌癥機構將其列入到2A類致癌物質[1].其可通過口腔、皮膚以及呼吸道等多種途徑進入人體中從而對生命安全造成威脅，因此檢測丙烯酰胺是非常必要的.尤其食物是丙烯酰胺的主要來源，尋求有效的快捷簡便且成本低廉的丙烯酰胺檢測分析方法極為重要，對此采用化學發光法對食品中的丙烯酰胺物質進行測定實驗，結果顯示魯米諾—過氧化氫化流動注射化學發光分析法是測定丙烯酰胺的有效方法，能有助于防范食品安全問題.

1 食物中丙烯酰胺測定研究進展

瑞典食品局在2002年發表聲明指出高溫油炸后的淀粉類食物中的丙烯酰胺含量偏高，美國、英國等國家先后報道證實了這一結果.FAO和WHO等組織機構先后召開了會議對食品中丙烯酰胺的安全性進行了討論并進行了危險性評估.丙烯酰胺早已成為了食品安全領域研究的熱點話題，眾多科學家及研究學者紛紛展開研究，探尋有效的丙烯酰胺測定分析方法.

李河山(2017)[2]采用了固相萃取-高效液相色譜分析方法對烹飪食物中的丙烯酰胺含量進行檢測，結果顯示在0.05～5.00 μg/mL濃度范圍內有著良好線性關系，RSD在1.8%～3.2%范圍內，李河山指出該方法是高效快速的檢測分析方法；肖曉茹等人(2018)[3]采用加壓毛細管電色譜法對辣條中丙烯酰胺進行分離檢測分析，實驗結果顯示能起到良好的分離作用，在2.0～32 μg/mL內具有良好的線性關系，相關系數高達99.9%，研究表明該分析方法能有效測定丙烯酰胺含量；Pedreschi(2010)通過近紅外光譜與視覺反射成像結合的方式形成了在線檢測模型，經過研究發現預測值的誤差僅為266 μg/kg，與實際檢測值的線性相關性達到了83%，指出該方法能實時對樣品中的丙烯酰胺進行分離[4]；Ayvaz(2015)利用便攜式紅外光譜儀對辣條中丙烯酰胺進行檢測分析有著良好的線性關系，標準誤差小于100 μg /kg[5].雖紅外光譜分析法具有高效、在線分析等特點，但是受到模型和參數的影響會造成檢測的不穩定性、靈敏度較低.

目前常用的丙烯酰胺包括色譜法、光譜法等方面，在化學發光法的檢測分析上，張羅一覽(2015)利用丙烯酰胺對高錳酸鉀-甲醛-抗壞血酸體系的抑制作用建立了運用化學發光法快速檢測水中丙烯酰胺的方法；高向陽與趙琛等人(2014)利用魯米諾-高錳酸鉀化學發光體系[6]，采用化學發光法對辣條等油炸食品的丙烯酰胺含量進行測定，總體而言用化學發光法對食品中的丙烯酰胺進行檢測分析的研究并不多見.化學發光檢測分析方法具有簡便、分析時間短、成本低廉等特點，將其應用到食物的丙烯酰胺檢測中具有很強的可行性.

2 化學發光法原理及特點

化學發光法，簡稱CL法，其是依據在某個時刻下化學發光所產生的發光強度或者發光總量進行組分含量測定的一種分析方法.化學發光反應指的是在進行化學反應的過程中，反應的中間體或產物的分子或原子吸收了反應過程中釋放的化學能而處于電子激發態，在回到基態的同時伴隨發出光輻射的一種現象[7].化學發光反應機制如下所示：

A+B→C*+D(激發)
C*→C+hv(發光)

化學發光反應需要滿足的能在反應過程中提供充足的激發能量、能產生激發態分子產物以及激發態分子產物能釋放出光子或者將能量轉移至其他的分子使其進入激發態發光并釋放出光子這三個必備條件.目前常見化學發光體系包括高錳酸鉀、過氧草酸酯類、酰肼類以及吖啶酯類等多種類型[8].為提高化學發光法的檢測分析效率與靈敏度，近年來化學發光法與流動注射技術相結合已經成為趨勢，彌補了傳統化學發光法的可控性差等缺點.整體而言流動注射化學發光法具有操作方法簡單、靈敏度高以及較寬線性范圍等諸多特點，是一種高效、便捷的檢測分析方法.

3 化學發光法測定食物中的丙烯酰胺

3.1 實驗設計

3.1.1 材料與試劑

本次實驗是對油炸類食物中的丙烯酰胺進行測定分析，對此在本地超市采購辣條、江米條作為實驗材料.本次實驗所需的試劑包括魯米諾(北京化工廠)、過氧化氫(天津市恒興化學試劑制造有限公司，30 g/100 mL)、丙烯酰胺標準品(國藥集團)、氫氧化鉀(國藥集團)等，其中除了丙烯酰胺標準品與魯米諾外，其它試劑均為分析純.實驗中所采用的水為二次去離子蒸餾水.

3.1.2 設備與儀器

本次實驗主要采用主要儀器與設備包括由西安瑞邁生產的IFFM-D型流動注射化學發光分析儀和IFFS-A型多功能化學發光檢測器、BS210S型電子分析天平(北京塞多利斯天平有限公司)、離心機(德國 Sigma)、旋渦混合儀(上海達姆)以及電熱恒溫鼓風干燥箱本次(浙江海得)等.

3.1.3 實驗溶液配制

實驗溶液主要包括丙烯酰胺標準溶液以及魯米諾溶液等，具體的配置方法如下：

丙烯酰胺標準溶液：將在55 ℃下烘干的0.0355 g丙烯酰胺標準品置于燒杯中，采用去離子蒸餾水溶解于50 mL的容量瓶中作為儲備液.使用時用去離子蒸餾水逐級稀釋至所需的標準溶液濃度；

魯米諾溶液(2×10-2mol/L)：用天平準確稱取3.5432 g的魯米諾，并用濃度為0.10 mol/L的氫氧化鉀進行溶解于1 L的棕色容量瓶中作為儲備液，遮光常溫保存14 d.

魯米諾溶液(4×10-4mol/L)：用吸量管吸取4 mL的魯米諾儲備液于容量瓶中，利用0.10 mol/L濃度的氫氧化鉀調節pH值到定容的200 mL刻度即可.

過氧化氫溶液(0.5 mol/L)：取10.2 mL的過氧化氫定容于棕色的200 mL的容量瓶.

Carrez Ⅰ溶液：將15 g的亞鐵氰化鉀與100 mL去離子蒸餾水混合；

Carrez Ⅱ溶液：將30 g 的硫酸鋅與100 mL去離子蒸餾水混合.

3.1.4 樣品預處理

將樣品粉碎后放入干燥箱內烘干至恒量，稱取5 g置于離心管內，依次加入10 mL的去離子蒸餾水、1 mLCarrez Ⅰ溶液、1 mLCarrez Ⅱ溶液和10 mL的正己烷后放置于震蕩儀中震蕩2 min，然后再放置在離心機上離心15 min后去除正己烷層，再使用0.22 μm濾膜過濾水相.將2 mL濾液用0.1 mol/L的乙二胺四乙酸二鈉溶液定容至25 mL.本次流動注射化學發光實驗測定方法流程如圖1所示：

圖1 流動注射化學發光實驗測定方法流程

4 結果與討論

將光電倍增管的負高壓設定為400 V，增益為1時，對化學發光儀器的參數進行優化.化學發光反應除了與發光體系的類型相關外，與反應介質的pH值、濃度等因素也是緊密相連的.為促使化學發光強度達到最大，需尋找最佳的化學發光反應介質.堿性環境下魯米諾溶液的發光性能較好[9]，對此設定魯米諾、過氧化氫與丙烯酰胺標準溶液的濃度分別為6×10-4mol/L、0.5mol/L和1×10-8mol/L條件，使用氫氧化鉀來調節魯米諾溶液的pH值，以0.5個pH值為變化測定，測定結果如圖2所示.從圖2中可以看出在pH=12.5時相對發光強度值達到最大.

圖2 PH值與相對發光強度的關系 圖3 魯米諾溶液濃度與相對發光強度的關系

在魯米諾溶液pH為12.5條件下，氧化氫與丙烯酰胺標準溶液的濃度與上次濃度一樣，考察不同魯米諾濃度下相對發光強度值的變化，包括1×10-5mol/L、3×10-5mol/L、5×10-5mol/L、7×10-5mol/L、1×10-4mol/L、3×10-4mol/L、4×10-4mol/L、5×10-4mol/L、7×10-4mol/L、1×10-3mol/L濃度，結果如圖3.從圖3可以明顯得到在魯米諾溶液濃度為4×10-4mol/L時發光強度達到最大.在pH=12.5，魯米諾濃度為4×10-4mol/L，丙烯酰胺標準溶液為1×10-8mol/L條件下，分別考察不同濃度下過氧化氫濃度對相對發光強度產生的影響，如圖4所示，當過氧化氫的濃度為0.5 mol/L時相對化學發光值達到最大.

圖4 過氯化氫濃度與相對化學發光值關系

綜合化學反應介質選擇實驗來看，應選擇pH=12.5、4×10-4mol/L濃度的魯米諾溶液，選擇0.5 mol/L的過氧化氫溶液才能促使化學發光效果達到最佳.

根據所設定的實驗參數，在pH=12.5、4×10-4mol/L濃度的魯米諾溶液和0.5mol/L的過氧化氫溶液的反應介質條件下對樣品進行測定實驗，丙烯酰胺濃度與相對化學發光的關系，實驗結果顯示，丙烯酰胺濃度在1×10-6～1×10-3mol/L范圍內有著良好的線性關系，相關度R2超過0.99，相關性系數r為0.993.在同等實驗條件下，對丙烯酰胺標準溶液(1×10-9mol/L)進行11次平行測定，通過3S/N方式計算出得到的方法檢出限為3.99×10-8mol/L.

在最優實驗條件環境下，進行了干擾實驗，當可容許的相對誤差在±5%范圍內時，100倍的K+、Na+、Cl-和50倍的Ca2+、Mg2+、Zn2+、Al3+、Fe3+等離子，以及3倍的酒石酸、檸檬酸、葡萄糖進行抗干擾的實驗.經過實驗測試表明，這些離子對于丙烯酰胺檢測沒有影響.表明化學發光檢測分析方法具有較高的選擇性及抗干擾能力.對辣條、江米條樣品待測液進行3次平行測定.進行加標回收實驗，同樣進行3次平行測定，取平均值作為實驗結果，如下表1所示.

表1 加標回收實驗結果

通過表1可以看出江米條A、B樣品以及辣條A中并未檢測出丙烯酰胺，辣條B樣品中檢測出1.13×10-6mol/L的丙烯酰胺，加標回收率在91.5%～98.6%范圍內.另外，對辣條B進行5次平行測定，測定的平均值為2.51 μg/g，相對標準偏差RSD僅為1.4%.

5 結 論

構建魯米諾—過氧化氫化學發光體系，采用流體注射化學發光法對辣條、江米條食物中多含的丙烯酰胺進行檢測實驗，實驗結果顯示在1×10-6～1×10-3mol/L丙烯酰胺濃度范圍內存在良好的線性關系，相關性系數為0.993，檢出限為3.99×10-8mol/L，加標回收率在91.5%～98.6%范圍內，RSD為1.4%.測定實驗結果顯示該方法在檢測油炸食品所含丙烯酰胺效果較為理想，檢測靈敏度高、成本低廉等優點，值得被廣泛應用于測定食物中的丙烯酰胺含量.