薏白湯對潰瘍性結腸炎大鼠的作用機制

師虹艷，張曉艷，霍永利，郭喜軍

(1.石家莊市中醫院，河北 石家莊；2.河北省中醫院,河北 石家莊)

0 引言

潰瘍性結腸炎(ulcerative colitis, UC)是一種異于尋常的免疫介導的腸道慢性、復發性、高發性炎癥性腸病，臨床常表現為左下腹、下腹部甚至全腹部陣痛、隱痛、灼痛、脹痛、酸痛，腹瀉、黏液膿血便等癥狀。病變可累及直腸、全結腸甚至末段回腸，其中乙狀結腸受累最明顯，病變主要局限于大腸黏膜與黏膜下層[1]。本文通過藥物治療潰瘍性結腸炎大鼠，檢測血清中IL-4 水平和腸粘膜ODC 表達情況，探討薏白湯對濁毒內蘊型潰瘍性結腸炎的作用機制，為臨床應用薏白湯治療潰瘍性結腸炎提供依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物

Wistar 雄性大鼠60 只，體重約(260 士20) g，購于醫學院實驗動物中心，合格證編號為SCXK(冀)2013-1-003。

1.2 動物飼料

大鼠喂養飼料為購于醫學院實驗動物中心的全價高營養顆粒，水為殺菌消毒過濾的純凈水。

1.3 實驗藥物

1.3.1 中藥

薏白湯的藥物組成：茯苓30g、白術6g、薏苡仁20g、葛根12g、升麻12g、秦皮12g、黃芩9g、黃連6g、地榆12g、陳皮12g、防風12g、白芍12g 等。藥物為新綠中藥免煎顆粒，將該藥物放置于熱蒸餾水全部溶解，配制為5g/mL 的高濃度混懸液；2.5g/mL 的中濃度混懸液；1.25g/mL 的低濃度混懸液。

1.3.2 對照組藥物

美沙拉嗪腸溶片，產品規格為125mg，批號為130116。藥物研碎，過100 目篩，溶解純凈水中，配制成濃度為0.05g/mL的美沙拉嗪混懸液。

1.4 試劑

2 實驗方法

2.1 實驗動物分組

適應性飼養1 周后，大鼠營養狀態較好，無死亡及生病現象，依照隨機數字表，將健康活潑Wistar 雄性大鼠均分為6組，分別為NN、M、MSLQ、HG、MG、LG。

2.2 動物模型制備

每組大鼠禁食水24 小時，稱體重、記錄、造模。以TNBS/乙醇復合法[2-3]建立UC 大鼠模型：將5% 的TNBS 與50%的乙醇溶液等體積比例混合成25mg(TNBS)/mL 混懸液，除NN 外，余組采用乙醚麻醉，待大鼠麻醉后將直徑約為0.2cm的硅膠管于肛門處插入大鼠結腸內，深度(8 士1)cm，按照100mg(TNBS)/kg 注入0.5mL 混懸液，注入完畢后將大鼠倒置約30s，待混懸液充分深入到大鼠末端大腸，隨后將大鼠逐一歸籠，待其自然清醒，大鼠清醒后觀察無萎靡、狂躁、撕咬等現象，與NN 組大鼠相比，精神狀態相差無幾，提示造模成功。

2.3 藥物灌胃治療

NN組及M組大鼠常規喂養，不予處理。造模成功后第4天，準備給予MSLQ、HG、MG、LG 藥物灌胃治療。給藥劑量根據正常成年人與大鼠體表面積比公式計算，MSLQ 組給0.05g/mL 美沙拉嗪混懸液，按體重400mg/(kg·d)，1 次/d；HG、MG、LG 組大鼠分別給予薏白湯高濃度混懸液，5g/mL，按體重32g/(kg·d)；中濃度溶液，2.5g/mL，按體重16g/(kg·d)；低濃度溶液，1.25g/mL，按體重8g/(kg·d)，均為1 次/d。灌胃給藥持續14 天。

2.4 標本采集及處理

14 天后，藥物治療完畢，稱重、記錄。各組大鼠禁食水24h，取試管，編號，采取斷頭法處死大鼠，處死大鼠同時迅速留取4mL 大鼠血液置于相應試管。待血液凝固后，置于TDL-5-A 離心機上，低溫轉速3000r/min，離心15min 后可以看到血清和血漿分離，此時取上層清液，置于-20℃下冷凍。后迅速用手術剪從大鼠腹部正中剖開，找出結腸組織，截取病變最明顯處，沿腸系膜縱軸剪開，置于生理鹽水中沖洗干凈，后放入40g/L 的多聚甲醛固定液中，固定待用。肉眼觀察結腸粘膜情況，可以看到結腸粘膜充血、糜爛、水腫、潰瘍、隱窩膿腫等，28h 后脫水，石蠟包埋，切片，HE 染色。

2.5 指標觀測

血清IL-4 含量采取放射免疫法，ODC 表達水平采取免疫組化法。

3 統計學方法

采用SPSS 13.0 統計軟件對所得數據進行處理分析，計量資料以(±s)表示，各組數據進行正態性及方差齊性檢驗，各組間采用單因素方差分析，兩組比較采用SNK-q 檢驗，P＜0.05 為差異有統計學意義。

4 結果

表1 IL-4 和ODC 評分比較Table 3 CoMparison of the levels of IL-4 and ODC (±s)

表1 IL-4 和ODC 評分比較Table 3 CoMparison of the levels of IL-4 and ODC (±s)

注： coMpared with NN, △P＜0.05；coMpared with M, #P＜0.05；coMpared with LG , ☆P＜0.05；coMpared with MG, □P＜0.05；coMpared with HG,○P＜0.05。

Group N IL-4(pg/Ml) ODC NN 10 0.910±0.024 0.110±0.010 M 9 0.587±0.059 △ 0.135±0.006 △LG 9 0.683±0.053 △# 0.152±0.005 △#MG 10 0.737±0.067 △# 0.188±0.022 △#☆HG 9 0.831±0.045 △#☆□ 0.282±0.044 △#☆□MSLQ 9 0.742±0.073 △#○ 0.185±0.014 △#☆○

5 討論

目前，潰瘍性結腸炎的發病機制各家分說，病因復雜多變，病情纏綿難愈，被世界衛生組織列為現代難治愈性疾病之一[4]。

5.1 目前多認為在中醫學上此病多屬“痢疾”“泄瀉”“腸澼”等范疇，認為此病與飲食結構、情志、氣候環境及遺傳等因素有關[5]。該病內經中稱“腸澼”。《素問·太陰陽明論》：“陽者，天氣也，主外……下為飧瀉，久為腸澼”。宋·嚴用和在《濟生方·痢疾論治》中首稱其為痢疾，云“今之所謂痢疾者，古所謂滯下是也”。而隋·巢元方在《諸病源候論·痢病候》中將痢疾分為“冷熱痢”“休息痢”等21 種痢候病。清·吳瑭在《溫病條辨》中指出本病：“濕溫內蘊，夾雜飲食停滯……遂成滯下，俗名痢疾，古稱重證，以其深入臟腑也”, 對痢疾的病因病機進行了論述。張仲景在《金匱要略》中云：“下利，便膿血者，桃花湯主之”“熱利下重者，白頭翁湯主之”“下利后更煩，按之心下濡者，為虛煩也，梔子豉湯主之”。指出濕熱、虛寒等痢疾的治法。明·李中梓《醫宗必讀·泄瀉》認為“無濕不成瀉”，并提出治瀉九法。綜上所述，歷代醫家指出了本病的病因病機及治法方藥等。本病的基本病機為邪蘊腸腑，氣血凝滯，傳導失司，脂膜血絡受損而成痢[6]，基本病變在腸，腸病及胃，《醫碥·痢》云：“不論何臟腑之濕熱，皆得以入腸胃，以胃為中土，主容受而傳之腸也。”其病理性質有虛、實、寒、熱之分，且復雜多變，一般初病多為實，遷延日久則虛實夾雜，疾病后期常以虛為主。吾師根據其臨床經驗總結認為UC 病因病機復雜不單一，病情纏綿反復，不易根治。隨著社會發展，人們飲食結構改變，嗜食肥甘之品較多，損脾傷胃；社會壓力較大，情志因素波動范圍較廣，影響肝之疏泄，肝胃不和，兩者均可使脾之運化受損，胃腐熟功能降低，濕濁內生；或先天脾胃虛弱，外感寒濕之邪不化，內外濕邪膠結日久為濁為熱為瘀為滯，熱之漸化為毒，濁毒、血瘀、氣滯等蘊結腸腑，敗濁始生，腸腑氣血滯澀不通，脂膜血絡受損，血肉腐敗。故本病病位在腸，與脾胃肝密切相關，且“濁毒”貫穿UC 疾病發生發展始終。在治療上強調化濁解毒、健脾除濕，恢復脾之健運，胃納如前，濕自化，濁自消，毒自解。并根據多年臨床經驗總結出薏白湯治療濁毒內蘊型潰瘍性結腸炎。藥物組成：黃芩9g，黃連6g，茯苓30g，白術6g，炒薏苡仁20g，葛根12g，升麻12g，秦皮12g，地榆12g，陳皮12g，防風12g，白芍12g，甘草6g，飛揚草9g，鳳尾草9g，葉下珠9g。具體方義如下：

5.2 方中黃芩、黃連清熱化濁解毒，善入脾胃清熱，一由肺下通三焦，一由胃及腸，為君藥，正如《素問·通評虛實論》所言：“五藏不平，六腑閉塞之所生也。”通過瀉肺火以清大腸濕熱，《神農本草經》云：“主諸熱黃疸，腸澼瀉痢”[7]，現代藥理研究黃連中含有多種生物堿，如小檗堿可以抑制胃液分泌、抗腹瀉、抗腸道細菌、抗毒素等[8-9]。黃芩中含有黃芩苷等，可抗炎抗變態反應，抑制腸管蠕動，抗氧化等[10]。茯苓、白術、炒薏苡仁健脾利濕化濁，為臣藥，《世補齋醫書》：“茯苓一味，為治痰主藥……痰之動，濕也，茯苓又可行濕”。現代藥理顯示茯苓、白術可抑制潰瘍、降低胃液分泌、增強免疫力，此外白術還可雙向調節腸管活動，薏苡仁還可鎮痛。陳皮、防風、芍藥三藥合用取痛瀉藥方之意，補脾瀉肝，緩痛止瀉，吳鶴皋說：“瀉責之脾，痛責之肝”，白芍酸寒，養陰柔肝斂脾陰，緩急止痛白芍可通過抗氧化功能清除細胞表面的自由基而保護細胞活性，抗應激抗炎，并可調節體內免疫功能[11]。陳皮歸脾肺經，主治中焦寒濕脾胃氣滯所致的泄瀉，與白術、茯苓同用可治療便溏舌淡，故陳皮與諸藥起相輔相成之功。陳皮中含黃酮類成分可對胃腸平滑肌行雙向調節作用[12]。防風味辛升清，微溫而燥濕，歸膀胱、肝、脾經，可用于脾虛濕盛、清陽不升所致的泄瀉，即所謂《內經》云“濕勝則濡瀉”是也。現代藥理分析防風中含有色原酮類、多糖類等，可有解熱鎮痛、抗炎等作用，其中多糖類能提高機體非特異性免疫反應[13]。葛根、升麻二者相合善引脾胃清陽之氣上升而止瀉，在《日華子本草》：“止血痢，通小腸，排膿破血”，亦說明本品可以止痢。葛根中主要為黃酮類化合物，可改善微循環、提高機體免疫力、松弛腸道平滑肌等[14]。升麻味辛微甘，歸肺脾胃大腸經，亦取其升舉陽氣之功，兩藥合用增強升陽止瀉止痢之功。升麻中含有升麻堿、升麻素等，抑制腸管痙攣，抑制5- 羥色胺誘導引起的腹瀉，并對大腸及痢疾桿菌起抑制作用[15-16]。秦皮清熱燥濕，善治濕熱下痢，現代藥理研究秦皮可抑制腸道細菌，抗炎[17-18]。地榆味苦酸澀，故可涼血止血，因其酸澀，故可澀腸而止痢，又因其性下降，故可治療下焦之便血、痔血。李時珍在《本草綱目》中云：“地榆治大小便血癥”。且研究顯示其收斂作用對潰瘍創面起護膜之效，煎劑可減輕組織水腫，抑制痢疾桿菌，明顯縮短出血及凝血時間[19]。飛揚草、鳳尾草、葉下珠：飛揚草歸肺膀胱大腸經，可清熱解毒止痢，利濕，主治赤白痢疾，泄瀉等。《福建民間草藥》云：“消癰解毒，利尿止痢”。吾師認為飛揚草、鳳尾草、葉下珠三藥合用可加強清熱解毒之功。飛揚草主要化學成分為黃酮類、丹寧類等，具有抗炎、抗菌、抗病毒[20]。鳳尾草主要功效為清熱利濕，解毒止痢，涼血止血，鳳尾草有廣譜抗菌作用，可抗病毒。李燕等研究顯示鳳尾草有明顯的止血作用，可升高血小板，故可用于治療血小板減少性出血[21-22]。葉下珠治療赤白痢疾，暑熱痢疾。葉下珠可消炎、殺菌[23]，為佐使藥。炙甘草：甘草味甘性平,可增強補益心脾之功，在方中起調和諸藥作用。

縱觀全方，健脾與化濁并用，調和氣血并兼消積導致，導師強調：“人以胃氣為本，而治痢尤要”故顧護胃氣應貫穿治療始終。全方結構緊密，配伍得當，共奏利濕化濁解毒之功。

5.3 目前國內外醫學認為，潰瘍性結腸炎是一種病因尚未完全明確，難以根治并易反復發作的頑固性非特異性炎癥性腸病。王張學蘭等人[24]研究發現在潰瘍性結腸炎的發生發展過程中，抑炎與抗炎因子兩者動態平衡遭到破壞，促炎因子占據優勢時，腸道黏膜遭到破壞，出現充血、潰瘍、糜爛等病變。結腸炎患者結腸粘膜有大量炎癥細胞浸潤，使用激素或者免疫抑制藥物干預后，癥狀可以有效緩解，病理組織學可以得到改善[27]。現在研究表明中藥在修復腸道黏膜等方面具有很好的療效[25-26]。張斌等人[28]研究發現運用活血化瘀、理腸通絡為主要原則治療潰瘍性結腸炎可以改善機體高黏狀態、調節機體免疫力從而使瘀血祛，腸腑暢，潰瘍愈，張曉峰等[29]亦認為UC 的炎癥程度與血液高黏狀態有關，血黏度越高炎癥越重，改善高凝狀態、提高機體免疫，清除細胞毒素和炎性產物，抑制腸黏膜異型增生，促進腸粘膜愈合。余今菁等[30]試驗研究表明，潰瘍性結腸炎患者腸道菌群失衡，腸黏膜免疫功能紊亂，繼發性引起致炎細胞因子/ 抑炎細胞因子紊亂。本實驗探討的IL-4 是來源于T 細胞的抑炎因子，其在潰瘍性結腸炎的發病發展中占據重要作用，其可抑制IL-1、TNF-α、超氧化物陰離子的形成，從而抑制IL-1的促炎作用[31]。王少鑫等[32]研究顯示在動物體內病變結腸黏膜處抑炎因子表達明顯減少，聚集大量促炎癥因子，提示結腸炎癥處于進展期。且多項人血清標本檢測亦證實，血清炎癥因子水平可在臨床上評估潰瘍性結腸炎的嚴重程度。

本實驗各組中，HG 組血清中IL-4 水平含量最高。在MG組、LG 組及MSLQ 組中含量均高于M 組，差異有統計學意義(P＜0.05)，而三組間差異無統計學意義(P＞0.05)。證明，薏白湯可以提高血清中IL-4 含量而抑制炎癥反應。鳥氨酸脫羧酶(ornithine decarboxylase, ODC) 是多胺代謝中的關鍵酶，主要在結腸黏膜層表達，正常情況下幾乎不表達，損傷后修復時表達較強。李茹柳等[33]認為ODC 在正常腸黏膜組織中表達較低，當腸黏膜受損時ODC 活性明顯升高、含量上升，而當受損腸黏膜進入修復階段時，ODC 作為細胞增殖過程中的啟動因子之一，ODC 表達最強。在本實驗中，NN 組中大鼠結腸粘膜中ODC 幾乎不表達，M 組及LG 組中ODC 呈低表達，而在HG 組中ODC 高表達，與其余各組相比具有統計學意義(P＜0.05)。證明薏白湯可以上調結腸粘膜中ODC 表達而提高組織粘膜修復能力。

綜上所述，薏白湯治療濁毒內蘊型潰瘍性結腸炎的機制可能是通過提高血清中IL-4 含量抑制炎癥反應，提高結腸黏膜中ODC 含量而提高受損黏膜的修復能力。