HR-HPV、CT、NG、UU DNA PCR 聯合陰道微生態檢測對宮頸癌篩查的研究

劉久磊

(山東省聊城市中醫醫院檢驗科，山東 聊城)

0 引言

宮頸癌是目前嚴重危害女性健康的惡性腫瘤之一。WHO的統計數據顯示，2018 年女性生殖道惡性腫瘤中，宮頸癌的發病率和死亡率均高居第一位[1-2]。宮頸癌的發病與性生活過早、性活躍、早年分娩、多產、病毒感染等多種因素相關[3]，其中以高危型人乳頭瘤病毒(HR-HPV)持續感染為主的生殖道感染及陰道微生態的改變是其發病的重要原因之一[4]。宮頸癌的發展一般經過上皮內瘤樣病變、早期浸潤癌、浸潤癌，發展歷程需要數年[5]。因此，采用高效的檢測方法對早期宮頸癌的篩查有重要意義。本研究針對宮頸癌、宮頸上皮內瘤樣病變及正常宮頸細胞人群的HR-HPV、CT、UU、NG 及陰道微生態相關指標分析，觀察上述指標在宮頸癌病變篩查中的價值。

1 材料和方法

1.1 研究對象

選取2018 年6 月至2019 年12 月在聊城市中醫醫院住院，經臨床表現、實驗室檢查、病理學檢查確診為宮頸癌患者21 例，確診為宮頸內上皮瘤(CIN)患者116 例，同時選取同期健康體檢者163 例作為對照組。研究對象年齡為19 歲-55 歲，平均年齡為(37.9±9)歲。所有研究對象均自愿進行HPV 基因分型檢測，生殖道病原體(CTNGUU)核酸檢測及陰道微生態檢測。

1.2 納入與排除標準

所有標本經聊城市中醫醫院倫理委員會審核批準，簽訂患者知情同意書。患者標本采集均需滿足以下情況：(1)患者均符合《婦科學》第八版(婦產科學(第8 版)[M].人民衛生出版社)中對宮頸病變的相關診斷標準；(2)3 日內非月經期；(3)24 小時內無性生活；(4)3 日內無陰道沖洗及陰道內置藥；(5)近期未進行HPV 分型檢測，STD 及陰道微生態的檢測。

1.3 標本采集

(1)HPV 及CTNGUU 檢測取樣：以窺陰器暴露宮頸，使用一次性宮頸脫落細胞采集器置于宮頸口，順時針旋轉3 至5 圈后，將其放入細胞保存液中送檢。(2)陰道微生態檢測樣本取樣：以無菌拭子在陰道后位或穹窿處旋轉10-20 秒，以能清晰看到分泌物附著為準，放入專用試管中送檢。

1.4 實驗儀器與試劑

人乳頭瘤病毒(23 個型)核酸分型檢測及CT/NG/UU 核酸檢測試劑盒(hybribio 公司)，陰道微生態檢測試劑(shidasi公 司)；Roche-LightCycler-480 實施熒光定量PCR 儀 及UNIT-700 陰道微生態檢測儀(Roche，瑞士)。

1.5 試驗方法及判定標準

1.5.1 HPV 分型檢測

(1)方法步驟采用實時熒光定量PCR 檢測技術對采集的標本進行測定，按照試劑盒要求在PCR 實驗室各區進行操作后上機進行擴增。(2)判定標準 Ct值＜40 者為陽性，否則為陰性。

1.5.2 CT/NG/UU 核酸檢測

步驟方法及判斷標準同HPV 分型檢測。

1.5.3 陰道微生態檢測

(1)方法步驟按照試劑盒要求進行采樣檢測。(2)判斷標準 PH 值≥4.6 為陽性。

1.6 統計學分析

采用SPSS 22.0 統計軟件，對結果進行統計處理，計數資料采用卡方檢驗進行分析，比較宮頸癌組、CIN 組/正常組的HPV 檢出率是否有統計學意義，比較HR-HPV 檢出率是否有統計學意義，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 三組受試者HPV 感染情況比較

分別對三組進行HPV 分型檢測，結果顯示：宮頸癌組HPV 感染陽性率為85.71%(18/21)；CIN 組陽性率為54.31%(63/116)；正常組陽性率為22.28%(37/163)。宮頸癌組HPV 檢出率分別與CIN 組和對照組比較差別有統計學意義(見表1)；其中宮頸癌組HR-HPV 亞型陽性率最高的前三個分別為HPV-16、HP-18、HPV-58。

表1 三組受試者HPV 感染情況比較

2.2 三組受試者CT、UU、NG、HR-HPV 的多重感染與陰道微生態的情況比較

三組受試者中宮頸癌組HR-HPV、CT、UU、NG 多重感染(簡稱多重感染)陽性率與CIN 組和正常組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，即宮頸癌組多重感染均高于CIN 組及正常組，說明多重感染與宮頸癌的發病密切相關(見表2)。其中多重感染的患者中，宮頸癌組的PH 陽性率與CIN 組及正常組相比，差異有統計學意義，說明宮頸癌患者同時合并陰道微環境失衡(見表3)。

表2

表3

3 討論

宮頸癌前病變發展為宮頸癌是一個漫長的過程，如果能及時早期發現宮頸癌并給予恰當的處理，宮頸癌是可以治愈的。因此，選擇合理、規范的宮頸癌早期篩查的方法對于提高其檢出率具有重要意義[6]。目前對于子宮頸病變的有效的實驗室篩查方法主要是HPV-DNA 分型檢查[7]。

近年來，隨著對宮頸癌的認識的加深，發現單純地HPV感染并不是導致宮頸癌的發生的唯一條件[8]，其他因素譬如生殖道感染也參與了宮頸癌的發生。洪恩[9]的研究表明，HR-HPV 感染與生殖道感染也有一定的相關性，與CIN 病變進展密切相關。生殖道感染不僅可以導致基底上皮細胞發生變化，在免疫力降低時，其還有助于HPV 病毒粒子的進入，并改變免疫應答途徑，從而降低宿主抵御HPV 感染的能力[10]；與此同時生殖道病原體協同持續感染的HR-HPV，進一步增高了女性宮頸癌變或癌前病變的概率。生殖道病原體中最常見的為CT、UU、NG[11]。有研究認為宮頸癌及癌前病變患者CT 及UU 陽性率均顯著高于正常婦女[12]；一旦感染CT，一般病程較長且絕大部分女性無臨床癥狀。在持續CT 感染下，細胞脫離信號機制，發生DNA 損害，增強了腫瘤發生的可能性[13]，同時CT 的感染破壞了上皮細胞的完整性，導致HPV進入基底上皮，因此CT 感染不僅是造成宮須癌的一個單獨危險因素，也會與HPV 感染產生協同作用[14]。UU 和HPV 感染聯系密切，其代謝過程中可產生尿素酶、IGA 蛋白酶等，造成了局部免疫力下降，增加機體對HPV 的易感性；尿素酶分解尿素產生的氨，引起陰道pH 值改變，導致陰道微生態的失衡，進一步增強HPV 的病毒表達。女性感染NG 后亦常常無臨床癥狀，有研究表明NG 和HR-HPV 在宮頸病變過程中有協同性作用[15]。以往因受限于對傳統檢驗方法的依賴，生殖道感染的檢出率在相關人群中被低估，直到引入PCP 等不依賴培養、血清學的分子技術 ，尤其是能夠同時檢測多種生殖道病原體的多重PCR 技術的使用，使得生殖道感染的診斷得到了全面革新。

陰道微生態與宮頸癌之間的相關性，是目前學者探討的熱點。陰道微生態系統是阻止HPV 侵入的第一道防線。它的各類指標中乳酸桿菌對HPV 和宮頸癌的影響中起著重要作用，一方面乳酸桿菌分解糖原產生乳酸來維持正常女性陰道PH 值，另一方面乳酸桿菌還具有產生抗腫瘤活性代謝產物及激活機體免疫系統等機制發揮其抗腫瘤的功效[16]。Korshunov VM 等[17]的研究表明陰道內乳酸桿菌的減少與宮頸癌前病變的發生密切相關。

本研究對宮頸癌、CIN 及正常宮頸細胞人群的HR-HPV、CT、UU、NG 及陰道微生態相關指標分析，結果顯示HPV-16、HP-18、HPV-58 可作為HR-HPV 的監測指標。在正常組中，多重感染陽性率均較低，PH 值陽性率較高，CIN 組與宮頸癌組中，PH 值陽性率逐漸降低，多重感染率則逐漸升高；同時多重感染合并PH ≥4.6 陽性率分別為71.4%、3.4%、0%，這說明HR-HPV、CT、UU、NG 及陰道微生態失衡在宮頸細胞病變及宮頸癌的發生發展過程中起著協同感染的作用。因此采用PCR 檢測HR-HPV 聯CT、NG、UU 聯合陰道微生態檢測能提高宮頸癌的篩查率并對預防宮頸癌有重要意義。