雞肉粉中豬源性成分的檢測(cè)分析

張文剛 姜 芹 孫冰清 張 妤 顧 欣

上海市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，上海201103

近2年來(lái)，由于非洲豬瘟的影響導(dǎo)致雞肉粉原料中摻假、摻雜豬肉粉現(xiàn)象頻發(fā)，不僅嚴(yán)重侵害了飼料生產(chǎn)廠(chǎng)家的利益，而且也給非洲豬瘟的防控帶來(lái)了很大安全隱患。為切實(shí)掌握飼料生產(chǎn)企業(yè)雞肉粉原料中豬源性成分的污染情況，本文對(duì)來(lái)自寵物食品生產(chǎn)企業(yè)、飼料檢測(cè)機(jī)構(gòu)、企業(yè)內(nèi)部質(zhì)量檢測(cè)機(jī)構(gòu)及第三方飼料檢測(cè)機(jī)構(gòu)提供的61 個(gè)產(chǎn)品進(jìn)行了豬源性成分檢測(cè)分析。目前，現(xiàn)有的動(dòng)物源性成分鑒別方法一般只是開(kāi)展定性檢測(cè)，結(jié)果以陰性或陽(yáng)性的形式報(bào)告，這類(lèi)檢測(cè)結(jié)果無(wú)法區(qū)分是污染還是故意摻假所致，無(wú)法有效甄別是否存在摻假行為及其嚴(yán)重程度。因此，開(kāi)展定量檢測(cè)技術(shù)研究來(lái)量化鑒別某一動(dòng)物源性成分含量十分必要[1-3]。本研究通過(guò)在雞肉粉中添加不同比例的豬肉粉制作豬源性成分的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定樣品中豬源性成分含量，基本實(shí)現(xiàn)了豬源成分的量化鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檢測(cè)樣品來(lái)源于寵物食品生產(chǎn)企業(yè)、雞肉粉生產(chǎn)、銷(xiāo)售企業(yè)及檢測(cè)機(jī)構(gòu)；無(wú)水乙醇，國(guó)藥集團(tuán)試劑有限公司；DNA 提取試劑盒，天根生化科技（北京）有限公司；豬源性檢測(cè)試劑盒，廣州維伯鑫生物科技股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Light Cycler 96 型實(shí)時(shí)熒光PCR 儀，瑞士Roche 公司；渦旋儀，德國(guó)Heidolph 公司；AB135-S/FACT 電子分析天平，梅特勒托利多儀器上海有限公司；離心機(jī)，美國(guó)Thermo Scientific 公司；Nanodrop 分光光度計(jì)，美國(guó)Thermo Scientific 公司。

1.3 方 法

1）樣品DNA 提取。本試驗(yàn)中DNA 提取采用天根生化科技（北京）有限公司生產(chǎn)的組織基因組DNA 提取試劑盒。稱(chēng)取約50 mg 試樣，裝入1.5 mL已滅菌的離心管中，然后按照試劑盒操作步驟進(jìn)行NDA 提取，DNA 提取溶液于-20 ℃保存。在提取樣品DNA 的同時(shí)，對(duì)陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照進(jìn)行同法操作。

2）標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)制備。本試驗(yàn)以純雞肉粉為基質(zhì)，純豬肉粉為添加物質(zhì)，分別配制豬肉粉含量為10%、1%、0.1%的樣品，同時(shí)以純豬肉粉為含量100%、純雞肉粉為豬肉粉含量0，提取DNA 后進(jìn)行定量檢測(cè)。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以lg（豬肉粉百分含量）為橫坐標(biāo)，以對(duì)應(yīng)的Ct 值為縱坐標(biāo)繪制檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

3）添加回收試驗(yàn)。以純雞肉粉為基質(zhì)，純豬肉粉為添加物質(zhì)，分別配制豬肉粉含量為50%、5%、0.5%的樣品，提取DNA 后進(jìn)行定量檢測(cè)。每個(gè)濃度重復(fù)測(cè)3 次，每次2 個(gè)平行，考察方法的回收率及變異系數(shù)。

4）樣品檢測(cè)。本試驗(yàn)以樣品DNA 提取液為模板，采用廣州維伯鑫生物科技股份有限公司提供的豬源性檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，引物序列為F：CGACAAAGCAACCCTCACAC，R：TGCGAGGGCG-GTAATGAT；探針序列為CTTCGCCTTCCACTTTATCCTGCCATTC。PCR 反應(yīng)體系為25 μL，其中2×牛羊源性成分檢測(cè)反應(yīng)液12.5 μL、牛羊源性成分檢測(cè)引物混合液和牛羊源成分檢測(cè)探針混合液各1 μL、模板DNA（1～100 ng/μL）2 μL，滅菌雙蒸水補(bǔ)足體系用量使總體積為25 μL。檢測(cè)過(guò)程中分別設(shè)陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照和空白對(duì)照。反應(yīng)條件為：預(yù)變性95 ℃10 s；變性95 ℃5 s,退火延伸60 ℃30 s（收集熒光信號(hào)），40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，利用儀器軟件處理分析擴(kuò)增曲線(xiàn)并確定循環(huán)閾值（Ct 值）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品DNA 提取

為保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本研究對(duì)樣品中提取的DNA 進(jìn)行質(zhì)量和濃度檢測(cè)，用核酸蛋白濃度檢測(cè)儀檢測(cè)所有樣品溶液的濃度，并稀釋至50 ng/μL 后使用，純度（D260nm/280nm）均在1.8～1.9 之間，表明提取的DNA 濃度和純度較好，可用于下一步試驗(yàn)[4]。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

按照純豬肉粉為100%、雞肉粉中豬肉粉含量為10%、1%、0.1%及純雞肉粉（豬肉粉含量0）的順序進(jìn)行檢測(cè)分析，同時(shí)以Ct值為縱坐標(biāo)，以lg（豬肉粉的百分含量）為橫坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)（圖1）。本方法線(xiàn)性方程為y=-2.911x+21.68，R2=0.998，顯示出較好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.3 回收率及變異系數(shù)

按照1.3 中3）進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，考察方法的回收率。本試驗(yàn)中豬肉粉的加標(biāo)回收率為90.9%～108.7%，變異系數(shù)≤5.7%（表1）。

2.4 實(shí)樣檢測(cè)

本研究對(duì)從不同環(huán)節(jié)收集到的61 批雞肉粉樣品進(jìn)行了豬源性成分檢測(cè)，其中檢出含有豬源性成分的樣品15 批，具體檢出情況見(jiàn)表2。

3 討 論

在目前的標(biāo)準(zhǔn)或文獻(xiàn)報(bào)道中，動(dòng)物源性成分檢測(cè)使用的檢測(cè)方法多是定性檢測(cè)方法，這些方法不能對(duì)摻假的樣品進(jìn)行定量分析，因此需要建立準(zhǔn)確性高、操作性強(qiáng)且易于推廣的定量檢測(cè)方法以滿(mǎn)足行業(yè)管理需求。本研究通過(guò)在雞肉粉中添加不同比例的豬肉粉制作豬源性成分的含量標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)確定樣品中豬源性成分含量，進(jìn)而判斷雞肉粉原料是否故意摻假并衡量其摻假程度。試驗(yàn)結(jié)果顯示，本方法中豬源性成分的檢測(cè)限達(dá)到了0.1%（g/g），豬源性成分在0.1%～100%含量范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)線(xiàn)性關(guān)系良好（R2達(dá)到0.99 以上），模擬混合樣品及實(shí)樣檢測(cè)均顯示該方法準(zhǔn)確度高、穩(wěn)定性好。

圖1 豬肉粉添加回收標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)

表1 血常規(guī)檢測(cè)結(jié)果

表2 雞肉粉中豬源性檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果

本文通過(guò)對(duì)市場(chǎng)上收集到的61 批雞肉粉進(jìn)行篩查檢測(cè)，初步掌握了雞肉粉中豬源性成分的含量及其污染情況。檢測(cè)樣品從抽樣環(huán)節(jié)上分，來(lái)源涵蓋了飼料檢測(cè)機(jī)構(gòu)、雞肉粉、經(jīng)營(yíng)和使用企業(yè)（寵物飼料生產(chǎn)企業(yè)）等各個(gè)環(huán)節(jié)；從產(chǎn)地上分，樣品包含了國(guó)內(nèi)產(chǎn)品和進(jìn)口產(chǎn)品兩類(lèi)，其中進(jìn)口產(chǎn)品6 批，國(guó)產(chǎn)樣品55 批，分別來(lái)自廣東、山東、四川、上海、湖北等地。在檢測(cè)的61 批雞肉粉樣品中，檢出含有豬源性成分的樣品15 批，總體檢出率為24.6%，其中含量超過(guò)10%的樣品有4 批，占6.55%，含量最高的甚至達(dá)到了純豬肉粉的程度；含量在0.5%～10%之間的有7 批，占11.5%；檢出但含量小于0.5%的有4 批，占6.55%；未檢出豬源性成分的有46 批，占75.4%。總體上來(lái)說(shuō)，市場(chǎng)上雞肉粉中豬源性成分的檢出率較高，應(yīng)當(dāng)加強(qiáng)對(duì)雞肉粉原料中豬源性成分的檢測(cè)和監(jiān)管。