基于分子對接技術模擬預測復明片對M膽堿受體的作用

黃丹梅　陳沛洪

摘? 要：【目的】采用分子對接技術模擬預測復明片與M膽堿受體的作用關系。【方法】建立復明片活性成分數(shù)據(jù)庫，采用Autodocking vina等軟件，以M膽堿受體蛋白激動劑 IX0作為配體，建立 M膽堿受體蛋白的活性位點，對復明片中活性成分進行分子對接模擬預測。【結果】以自帶配體IX0（-6.5 kcal/mol）為閾值，復明片中共有217種成分與 M膽堿受體蛋白對接親和力在閾值之上。復明片中活性成分主要作用于以ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111等氨基酸殘基組成的活性位點。【討論】復明片中活性成分與M膽堿受體蛋白能夠成功進行分子對接，其對接位點信息有助于研究復明片活性物質(zhì)與M膽堿受體的作用機制的闡釋及發(fā)現(xiàn)新型抗青光眼藥物提供參考。

關鍵詞：復明片;活性成分;M膽堿受體蛋白;分子對接

中圖分類號：R276? ? ? ? ?文獻標志碼：A? ? ? ? ?文章編號：2095-2945（2020）21-0005-04

Abstract： Objective： The molecular docking technology was used to simulate and predict the relationship between Fumingpian tablets and M choline receptors. Methods： We established the active ingredient database of Fumingpian tablets， used software such as Autodocking vina， and used M choline receptor protein agonist IX0 as a ligand， so as to establish the active site of M choline receptor protein and perform molecular analysis on the active ingredients in Fumingpian tablets Docking simulation prediction. Results： Taking the self-ligand IX0 （-6.5 kcal/mol） as the threshold， a total of 217 components in Fumingpian tablets have a docking affinity with M choline receptor protein above the threshold. The active ingredients in Fumingpian tablets mainly act on ALA-194， ASN-108， ASN-404， ASP-103， CYS-429， PHE-195， SER-107， TRP-155， TRP-400， TYR-403， TYR -426， TYR-430， VAL-111 and other active sites composed of amino acid residues. Discussion： The active components of Fumingpian tablets can successfully dock with M-choline receptor proteins， and the information of their binding sites is helpful to study themechanism of interaction between active substances and M-choline receptors， and provide a reference for the discovery of new anti-glaucoma drugs.

Keywords： Fumingpian tablets; active ingredients; M choline receptor protein; molecular docking

前言

青光眼是一種以眼壓急劇升高并伴有相應癥狀和眼前段組織改變?yōu)樘卣鞯难鄄。湟滓鹨暳ο陆怠⒁曇叭睋p等后遺癥，是一種致盲率較高的眼疾病。青光眼的致病原因是復雜的、多方面的，或與全身疾病有著密切的關系，目前尚有部分患者病因不明。例如急性閉角型青光眼，其發(fā)病急劇，視力可數(shù)日內(nèi)迅速下降，甚至失明，而原發(fā)性閉角型青光眼則發(fā)病隱匿，進展緩慢，早期患者無自覺的癥狀，隨著眼壓長期對視神經(jīng)的壓迫造成損害，患者才會發(fā)現(xiàn)視力下降，此時視神經(jīng)已經(jīng)有了一定的損害了[1]。一般認為，高眼壓、缺血等原發(fā)性損傷因素首先引起敏感性視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞的崩解死亡，崩解產(chǎn)物致使躲過原發(fā)損傷的視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞進入凋亡程序而最終丟失，它是青光眼患者視神經(jīng)病變進展的最主要因素。對于本病的治療目前主要是通過藥物和手術來降低眼壓及保護視神經(jīng)藥物以延緩青光眼的發(fā)病進程[2]。

復明片為補益類中成藥，有滋補肝腎，養(yǎng)陰生津，清肝明目之功效。主治肝腎陰虛所致的畏光、視物模糊。適用于青光眼，初、中期白內(nèi)障見上述證候者。臨床研究證實服用復明片能有效改善青光眼患者高眼壓及視神經(jīng)損傷等癥狀;實驗研究發(fā)現(xiàn)復明片水溶液給家兔滴眼可明顯縮小瞳孔直徑，降低眼內(nèi)壓的作用。因而我們大膽猜想，復明片的有效成分中可能有擬膽堿樣作用的成分組存在[1，3，4]。

1 方法

1.1 試驗藥物

復明片總方的所有有效成分結構

1.2 使用軟件

Atoudocking vina 1.1.2、Pymol 1.7、Atoudocktool-1.5.6

1.3 復明片總方分子數(shù)據(jù)庫的建立

通過查找及中國天然產(chǎn)物化學成分庫（http：//pharmdata.ncmi.cn/cnpc/）及TCMP數(shù)據(jù)庫（http：//ibts.hkbu.edu.hk/LSP/index.php），檢索復明片中中草藥的化學成分。全方共計1181個化學成分，采用ChemBioDraw Ultra 12.0畫出化合物LIN的結構，然后用ChemBio3D Ultra 12.0轉化為三維結構，并使用MMFF94力場進行優(yōu)化，輸出mol2結構，后通過Atoudocktool-1.5.6軟件轉變?yōu)?pdbqt格式。

1.4 作用靶點的選擇

通過在TTD數(shù)據(jù)庫搜索青光眼治療靶點，搜索到M膽堿受體蛋白（PDB ID：4MQS）。在RCSB蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（www.rcsb.org）上，下載具有蛋白質(zhì)-配體復合物的晶體，通過Atoudocktool-1.5.6及其附帶的激動劑化合物確定作用位點的三維坐標。

1.5 分子對接模擬試驗

本課題采用Atoudocking vina 1.1.2進行分子對接研究。按照以上坐標參數(shù)進行模擬對接。為了增加計算的準確度，我們將參數(shù)exhaustiveness設置為20。除了特別說明，其他參數(shù)均采用默認值。最后，選取打分值最高的幾個構象用PyMoL 1.7進行結果分析[5-8]。

2 結果

通過Atoudocking vina 1.1.2批量對接可得到復明片1181個化合物，能與M膽堿受體蛋白有效的對接的化合物共611個，高于原激動配體的化合物共217個，占比約35.51%。將高于原激動配體的化合物親和力的絕對值前10個化合物用pymol軟件作圖分析得到表1。選擇對接活性較高，與活性口袋有氫鍵連接的neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine與原配體IX0作圖對比。

蛋白的原配體IX0、neocnidilide及N-Salicylidene-salicylamine與M膽堿受體蛋白的分子對接圖1表示IX0與M膽堿受體蛋白的分子對接圖： 左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111）。

圖2表示neocnidilide與M膽堿受體蛋白的分子對接圖：左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-426、VAL-111、TYR-104）。

圖3表示N-Salicylidene-salicylamine與M膽堿受體蛋白的分子對接圖： 左圖球棍狀代表化合物，線條部分代表與化合物臨近的氨基酸殘基，飄帶表示M膽堿受體蛋白。右圖顯示出了對接活性口袋及其二維圖（ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111、TYR-104）。

根據(jù)對比發(fā)現(xiàn)，復明片的活性物質(zhì)均共同作用于同一群活性口袋：ALA-194、ASN-108、ASN-404、ASP-103、CYS-429、PHE-195、SER-107、TRP-155、TRP-400、TYR-403、TYR-426、TYR-430、VAL-111。這些數(shù)據(jù)證明復明片的活性物質(zhì)能有效作用M膽堿受體蛋白。

3 討論

分子對接方法是依據(jù)受體學的“鎖和鑰匙”原理，從已知結構的受體和原配體出發(fā)，通過化學計量方法模擬、 識別并預測受體-配體復合物結構的方法[9]。該方法可以預測蛋白質(zhì)復合物的結構和結合位點，在藥物設計中具有重要作用，并已廣泛用于藥物虛擬篩選、定量構效關系研究[10]。復明片臨床用于青光眼治療由來已久，然而對其何種有效成分作用何種蛋白的研究卻甚少，且分子對接模擬的研究報道不多。

治療青光眼的機制有多種，如抑制β受體以減少房水的生成;激動M膽堿受體使之縮瞳從而促進房水流出[11]。有研究發(fā)現(xiàn)復明片的10%的水浸液對實驗家兔的瞳孔有明顯縮瞳作用和降低眼壓作用，其可能有擬膽堿樣作用。因而作者選用M膽堿受體蛋白與復明片的有效成分進行對接，探討了復明片對于抗青光眼降眼壓的潛在影響[1]。

M膽堿受體，又稱M受體，能與毒蕈堿特異性結合并被激動的膽堿受體稱為毒蕈堿型膽堿受體（muscarinic receptor，M受體），主要分布于節(jié)后膽堿能神經(jīng)纖維所支配的效應器細胞膜上。擬膽堿藥-毛果蕓香堿主要作用于副交感神經(jīng)（包括支配汗腺的交感神經(jīng)）節(jié)后纖維支配的效應器官的M膽堿受體，滴眼后可引起縮瞳、降低眼壓和調(diào)節(jié)痙攣等作用[1，12]。中藥復明片為臨床上常用的中成藥，其抗青光眼的療效已被證實。然而其抗青光眼的機制卻鮮有人研究。作者通過分子對接預測其有效成分中擬膽堿樣作用的成分，發(fā)現(xiàn)復明片成分中共有217個有高于原蛋白激動配體的作用。其中以neocnidilide、（+）-alpha-Curcumene、beta-Bisabolen等有效成分對M膽堿受體有較高的親和力。這些對接信息將為研究新型抗青光眼擬膽堿藥提供參考依據(jù)。

4 結論

復明片中的有效成分有三成可與M膽堿受體對接，這預示復明片的有效成分可能對M膽堿受體有效，且其中部分有效成分有比原配體更高的結合力，其結構可作為將來新的擬膽堿藥的設計母體。

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