一種硒代蛋氨酸衍生物的合成表征與安全性評價

唐燦　樊慶濤　王文龍　劉俊奇　劉梁　趙玲　陳新

摘要 以L-硒代蛋氨酸、月桂酰氯和油酰氯為主要原料通過肖頓-鮑曼縮合和酯化反應得到了N-酰基-L-硒代蛋氨酸衍生物，產物運用核磁共振（NMR）技術（1H NMR，13C NMR）表征確認。采用噻唑藍（MTT）比色法研究了目標化合物對人體正常肝細胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）的細胞毒性。結果表明，合成的目標化合物對人體正常肝細胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）細胞毒性較低，當2種目標化合物的濃度達1 920 μmol/L時，細胞存活率均大于75%，證明合成的硒代蛋氨酸衍生物是一種低毒的硒代化合物，對于擴大硒代蛋氨酸在油脂類食品和農產品加工領域的應用具有一定潛力。

關鍵詞 L-硒代蛋氨酸衍生物;合成;核磁共振表征;細胞存活率

中圖分類號 O621.3文獻標識碼 A文章編號 0517-6611（2020）13-0162-03

Abstract NacylLselenomethionine derivatives were synthesized by Schotten-Baumann condensation using Lselenomethionine， lauroyl chloride and oleoyl chloride as the main raw materials， and then esterified with methanol to obtain the NacylLselenomethionine methyl ester. The product was characterized and confirmed by nuclear magnetic resonance （NMR） technology （1H NMR， 13C NMR）.In addition， the cytotoxicity of the target compound on human normal liver cells （HL7702） and rat renal tubular epithelial cells （NRK52E） was studied by MTT colorimetry. The results showed that two synthesized target compounds were less cytotoxic to human normal liver cells （HL7702） and rat renal tubular epithelial cells （NRK52E）. When the concentration of two target compounds reached 1 920 μ mol/L， the cell survival rate was greater than 75%， which proved that the synthetic selenomethionine derivative is a lowtoxic selenomethine compound and has certain potential for expanding selenomethionine in the field of oily food and agricultural products processing.

Key words Lselenomethionine derivative;Synthesis;NMR characterization;Cell survival rate

硒是一種重要的生命必需元素。目前一些研究發現，動物和人體硒元素的攝取率與一些癌癥的死亡率呈負相關[1]。硒元素的缺乏還與我國一些常見的地方病如克山病和大骨節病密切相關，并且動物體或人體長期處于缺硒狀態，會導致白內障患病概率升高[2-3]。另外，在一些報道中，硒在人體內還具有清除自由基、抗衰老和提高免疫力的功能[4-5]，并且還能預防心血管疾病等慢性疾病[6-8]。目前，對于人體或動物體的補硒產品，以有機硒為主要應用方式。有機硒生物相容性更好，利用率高且毒性小，而其中的硒代氨基酸類更容易被動物體和人體吸收[9-10]。硒代氨基酸是自然界中硒以有機形式存在于動植物中的一種化合物，是利用率最高的一種有機硒化物[11-12]，它廣泛存在于一些富硒產地的天然植物中，可以作為補硒氨基酸的重要來源。在恩施地區生長的一些植物種中，硒存在的主要形態為硒代胱氨酸和硒代蛋氨酸[13]。這些富硒地區的植物可以為硒代蛋氨酸的應用提供豐富的來源。然而，硒代蛋氨酸作為補硒氨基酸的應用存在一些問題，由于氨基酸的脂溶性較差，所以無論在食品飼料還是在醫藥等應用領域，都以水溶性氨基酸來添加應用，限制了其在油脂基食品和藥物等方面的應用，因此通過增加氨基酸脂溶性基團，使其脂溶性增強，可以在保持其原有活性的基礎上，擴大其在油脂類食品醫藥和農業等方面的應用范圍。

該研究選取L-硒代蛋氨酸為原料，通過Schotten-Baumann縮合反應[14-16]和甲酯化反應[17]合成一種N-酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯衍生物，通過增加L-硒代蛋氨酸疏水基團，改變硒代氨基酸的表面活性，增強其脂溶性，從而增加其對生物膜的通透性。通過對硒代蛋氨酸這種修飾，不僅可擴大硒代蛋氨酸的應用范圍，還能為富硒植物中硒代蛋氨酸的加工應用提供一種新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

L-硒代蛋氨酸（湖北信康醫藥化工有限公司）;月桂酰氯（上海阿拉丁生化科技股份）;油酰氯（上海阿拉丁生化科技股份）;四氫呋喃（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;硫酸（分析純，國藥集團化學試劑有限公司）;含有10%胎牛血清DMEM（高糖）培養液（北京索萊寶科技有限公司）;人體正常肝細胞（HL-7702）、大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）[上海吉凱基因生物科技有限公司（10 000/孔），來源CTCC];MTT溶液（5 g/L，北京索萊寶科技有限公司）;其他試劑均為分析純;試驗用水為二次蒸餾水。

1.2 儀器與設備

OHAUS STARTER 3100 pH計（奧豪斯儀器（上海）有限公司）;DF-101B集熱式磁力加熱攪拌器（常州市金壇友聯儀器研究所）;BUCHI R-100旋轉蒸發儀（瑞士步琦有限公司）;Bruker-500型核磁共振波譜儀（布魯克（北京）科技有限公司）;PerkinElmer EnSpire 多功能酶標儀（珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司）。

1.3 合成方法

目標化合物的合成路線如圖1所示，以6a的合成為例。取500 mg的L-硒代蛋氨酸溶于10 mL的KOH溶液中，將此溶液加入到100 mL的三頸燒瓶中置于冰浴條件下攪拌。量取月桂酰氯1.2 mL使其溶解于10 mL THF溶液并置于分液漏斗中。向三頸燒瓶中以5 s/滴的速度滴加月桂酰氯的THF溶液，并同時向其中緩慢滴加KOH溶液，使pH保持在9。滴加完畢后，置于25 ℃水浴條件下攪拌反應2 h，隨后向其中滴加稀鹽酸溶液使pH達1～2。反應完成后取出到分液漏斗中，加入乙酸乙酯30 mL萃取3次，合并有機相后，將萃取液用飽和食鹽水洗滌2次后減壓濃縮。蒸干后經快速硅膠柱層析純化后得到5a N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸白色固體386.2 mg，產率為77.24%。取500 mg N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸于反應燒瓶中，加入10 mL 5%的硫酸-甲醇溶液，振搖均勻后，在60 ℃加熱30 min，反應完畢后，用正己烷萃取2次，取上層清液后減壓濃縮，過柱層析純化后得到6a N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯白色固體374.2 mg，產率為74.84%。

1.4 N-酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯對人體正常肝細胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）的細胞毒性評價

采用噻唑藍（MTT）[18-19]比色法對合成的N-酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯的細胞毒性進行測試。取對數生長期的人體正常肝細胞（HL-7702）和大鼠腎小管上皮細胞（NRK-52E）懸浮于含10 %胎牛血清培養液的DMEM高糖細胞培養基中，接種于96孔板中，每孔大約1×104個細胞，將96孔板放置于37 ℃，5% CO2的培養箱中培養，經過24 h后取出，分別加入0、80、160、240、320、640、1 280、1 920 μmol/L濃度的合成目標化合物，各組設平行重復的6孔進行試驗。在給藥后，將96孔板繼續置于二氧化碳培養箱中培養24 h，然后每孔加入10 μL MTT液（5 g/L）進行染色，在培養箱中繼續培養4 h，棄去上清液，每孔加入150 μL二甲亞砜（DMSO），搖勻后，用酶標儀檢測每孔在490 nm處的吸光度值，按如下公式計算細胞存活率。2 結果與分析

2.1 產物的結構表征

運用NMR核磁共振技術分別對產物進行了1H NMR，13C NMR結構確認，化合物5a白色固體，產率為77.24%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 10.30（s，1H），6.67（d，J = 7.6 Hz，1H），4.66（td，J = 7.4，5.0 Hz，1H），2.52（t，J = 7.7 Hz，2H），2.27-2.20（m，2H），2.20-201（m，2H），1.95（s，3H），1.64-1.54（m，2H），1.35-1.14（m，16H），0.84（t，J = 6.8 Hz，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 174.66，174.47，52.59，36.41，32.50，31.86，29.60，29.58，29.48，29.31，29.30，29.21，25.70，22.63，20.23，1407，4.11。

化合物5b黃色油狀液體，產率為68.77%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 9.78（s，1H），6.62（d，J = 4.4 Hz，1H），5.32（ddt，J = 15.9，5.7，2.9 Hz，2H），4.67（td，J = 7.4，5.0 Hz，1H），2.52（t，J = 7.7 Hz，2H），2.26- 2.22（m，2H），2.13-2.00（m，2H），1.98（d，J = 10.5 Hz，2H），1.96（s，3H），1.92（dd，J = 11.3，6.6 Hz，2H），1.65-1.53（m，2H），1.33-119（m，20H），0.89-0.80（t，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 174.55，174.46，129.95，129.63，52.55，36.40，32.57，32.51，31.86，29.72，29.69，29.62，29.48，29.28，29.22，29.13，2719，27.15，25.67，22.64，20.21，14.08，4.12。

化合物6a白色固體，產率為74.84%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 6.26（d，J = 7.9 Hz，1H），4.68（td，J = 7.6，5.1 Hz，1H），3.71（s，3H），2.48（ddd，J = 8.5，6.6，3.2 Hz，2H），2.24-2.14（m，3H），2.06-1.98（m，1H），1.95（s，3H），1.63-1.55（m，2H），1.29-1.18（m，16H），0.83（t，J= 6.8 Hz，3H）。13CNMR（101 MHz，cdcl3）δ 173.10，172.56，5240，52.14，36.47，32.87，31.84，29.55，29.54，29.44，2929，29.27，29.20，25.57，22.61，20.24，14.05，4.15。

化合物6b黃色油狀液體，產率為68.71%。1H NMR（400 MHz，Chloroform-d）δ 6.29（d，J = 7.9 Hz，1H），5.42-5.20（m，2H），4.67（td，J = 7.6，5.1 Hz，1H），3.70（s，3H），2.54-2.41（m，2H），2.20-2.16（m，2H），2.04-1.96（m，2H），1.93（s，3H），1.90（dd，J = 10.0，5.2 Hz，2H），1.62-1.55（m，2H），1.23（d，J = 14.3 Hz，20H），0.86-0.80（t，3H）。13C NMR（101 MHz，cdcl3）δ 173.04，172.53，129.88，129.63，52.35，52.12，36.40，32.82，32.53，31.83，29.69，29.64，29.58，29.45，29.24，29.20，29.08，27.14，27.10，25.55，22.61，20.26，14.05，4.11。

2.2 目標化合物細胞毒性結果

圖2和3分別為目標化合物6a和6b在0、80、160、240、320、640、1 280、1 920 μmol/L濃度下對于HL-7702細胞和NRK-52E細胞存活率的影響，由圖可以看出，當6a和6b濃度在0～1 920 μmol/L時對細胞存活率的影響不顯著。6a和6b對于HL-7702細胞和NRK-52E細胞存活率均具有濃度依賴性，隨著2種化合物濃度的升高，細胞存活率均下降。但在化合物濃度為1 920 μmol/L時，細胞存活率均在75%以上，證明2種化合物的細胞毒性較小。

3 結論

（1）以L-硒代蛋氨酸、月桂酰氯和油酰氯為主要原料通過肖頓-鮑曼縮合合成了N-酰基-L-硒代蛋氨酸，經酯化反應得到N-酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯，產物運用核磁共振技術

（1H NMR，13C NMR）進行表征確認。

（2）對合成的目標產物N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯和N-油酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯進行了細胞毒性評價，應用MTT比色法研究了2種化合物對HL-7702和NRK-52E細胞存活率的影響。2種化合物隨著濃度的增加，細胞存活率逐漸降低，但在1 920 μmol/L濃度時，總體細胞存活率都高于75%，表明N-月桂酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯和N-油酰基-L-硒代蛋氨酸甲酯的細胞毒性均不顯著。

該試驗合成的目標化合物可以作為一種補充動物或人體的硒元素潛在化合物，合成工藝簡便，目標產物不具有細胞毒性。與以往的硒代氨基酸產品相比，目標化合物具有較強的脂溶性，可應用添加于一些食用油類或油脂類食品飼料中，擴大了硒代蛋氨酸的應用范圍，為富硒植物農產品中硒代蛋氨酸的加工生產提供了一種新的思路。

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