超聲輔酶法提取豌豆蛋白及其抗氧化活性研究

戴媛　張忠琴　喬思琪　冷進松

摘要 為優化豌豆蛋白提取工藝條件，深入了解其生理功能活性，拓寬豌豆蛋白的產品范圍，以干豌豆為研究對象，采用超聲輔酶法提取豌豆粉中的蛋白質，優化提取工藝條件并測定提取產物的體外抗氧化活性。在試驗范圍內，最佳提取工藝條件如下：料液比為1∶30（g∶ mL），提取時間為50 min，提取次數3次，超聲波功率為150 W。在此工藝條件下得豌豆蛋白提取率高達95.64%，其抗氧化活性測定結果如下：DPPH·自由基的清除率為51.5%，超氧陰離子自由基清除率為54.5%，羥自由基清除率為56.3%，還原力為0.54。因此，優化的提取工藝合理、可行，豌豆蛋白具有較強的抗氧化活性。

關鍵詞 豌豆蛋白;超聲輔酶法;提取;抗氧化活性

中圖分類號 TS201.1文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）13-0165-06

Abstract In order to optimize the extraction conditions of pea protein，deeply understand its physiological function and activity，and broaden the product range of pea protein，the protein from pea powder was extracted by ultrasonic coenzyme method with dried pea as the research object.The extraction conditions were optimized and the antioxidant activity of the extracted products in vitro was determined.The results of the optimum extraction conditions within the scope of experimental research were as follows：the ratio of raw material to water 1∶30（g∶ mL），extracted 50 minutes，3 times，ultrasonic power 150 W.Under those conditions，the extraction rate of pea protein was up to 95.64%.The results of antioxidant activity were as follows：the scavenging rate of pea protein to DPPH·，superoxide anion and hydroxyl radical was 51.5%，54.5% and 56.3%，respectively，and the reducing ability was 0.54.Therefore，the optimization of pea protein extraction process technology was reasonable and feasible，and pea protein had stronger antioxidant activity.

Key words Pea protein;Ultrasonicassisted enzymatic method;Extraction;Antioxidant activity

豌豆（Pisum sativum Linn，pea），別稱麥豌豆、寒豆、麥豆、雪豆、畢豆、麻累、國豆、蠶豆（吳語）等，原產于地中海南部及地中海沿岸，是一種營養性食品[1]。豌豆種子富含蛋白質、碳水化合物、膳食纖維、維生素和礦物質等，其中蛋白質含量達20.6%[2]，豌豆蛋白具有抗氧化、抗癌防癌、抗菌消炎和增強機體免疫力等多種生理功能[3]，在眾多功能中，抗氧化作用是其發揮其他生理功能的基礎。目前有關豌豆蛋白的研究多針對于理化特性，而關于其生理功能尤其是抗氧化功能的研究較少。系統地研究豌豆蛋白的抗氧化功能有助于深入挖掘豌豆蛋白的其他生理功能，并為其他生理功能的深入研究奠定基礎。

目前國內外提取豌豆蛋白的方法主要有物理法（超濾膜法、超聲波提取法）、化學法（鹽析法、沉淀法）和生物學法（酶水解法）3種。將超聲波提取技術與酶水解2種提取方法有機結合，也就實現了物理法與生物學法之間的結合，進而得到一種具有提取率高、提取時間短、工作效率高等優點的超聲輔酶法。該研究采用超聲輔酶法提取豌豆蛋白，設置合理的工藝條件，確定最佳工藝參數，使豌豆蛋白提取工藝得到優化，提高豌豆蛋白提取率，并測定提取產物豌豆蛋白的抗氧化活性，以期為豌豆蛋白的深入研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 豌豆，網絡購買，產于河南商丘;堿性蛋白酶購自浙江博南生物科技有限公司;考馬斯亮藍G-250購自上海遠慕生物科技有限公司;牛血清蛋白購自蘇州達麥迪生物醫學科技有限公司;1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）購自合肥巴斯夫生物科技有限公司;三羥甲基氨基甲烷和鄰苯三酚購自成都市科龍化工試劑廠;其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備 UV 2600型紫外可見分光光度計（上海天美科技科學儀器有限公司）;TG16W高速離心機（長沙平凡儀器儀表有限公司）;SB-5200 DTDN超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）;RRH-250型高速多功能粉碎機（上海緣沃工貿有限公司）;KDN-102C凱氏定氮儀 （上海纖檢儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 豌豆蛋白提取的工藝流程。干豌豆→粉碎成粉→加水混勻→加酶→調節溶液pH（酶的最適pH）→在超聲波輔助提取下提取一定時間→100 ℃水浴，滅酶10 min→6 000 r/min 離心15 min→去掉上層的脂肪結塊和下層沉淀→收集中間的清液→分光光度計測吸光度→計算蛋白質含量。

1.3.2 豌豆基礎成分的測定。水分：常壓干燥法，參照GB/T 5009.3—2016[4];蛋白質：凱氏定氮法，參照GB/T 5009.5—2016[5]。

1.3.3 蛋白含量測定。

1.3.3.1 繪制標準曲線。以牛血清白蛋白為標準樣品，采用考馬斯亮藍法測定其含量，以吸光度值（A）為橫坐標，蛋白質濃度（μg/mL）為縱坐標，繪制標準曲線[6]。

1.3.3.2 蛋白含量測定。取0.3 mL提取液于試管中，加015 mol/L氯化鈉溶液定容至1 mL，加5.0 mL考馬斯亮藍溶液后搖勻，在595 nm波長下測定吸光值。與標準曲線對比，計算蛋白質含量[7]。

1.3.4 單因素試驗。采用“1.3.1”方法提取蛋白質，固定提取條件為提取次數3次、提取時間50 min、超聲波功率150 W，考察不同料液比對豌豆蛋白提取率的影響;固定提取條件為提取次數3次、料液比1∶30（g∶mL）、超聲波功率150 W，考察不同提取時間對豌豆蛋白提取率的影響;固定提取條件為料液比1∶30、超聲波功率150 W、提取時間50 min，考察提取次數對豌豆蛋白提取率的影響;固定提取條件為提取次數3次、料液比1∶30、提取時間50 min，考察超聲波功率對豌豆蛋白提取率的影響。

1.3.5 響應面試驗設計。在單因素試驗的基礎上，利用Design Expert軟件的Box-Behnken試驗設計原理，以豌豆蛋白提取率為響應值（Y），以料液比（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、超聲波功率（D）為自變量，設計四因素三水平響應面分析試驗，以優化豌豆蛋白提取工藝。因素與水平設計見表1。

1.3.6 抗氧化活性測定。取最佳工藝條件下制得的蛋白質提取液，測定其抗氧化活性。

1.3.6.1 DPPH·自由基清除率的測定。參考Teng等[8]的方法，并略作修改：將配成不同底物濃度的蛋白溶液2 mL和0.2 mmol/L的DPPH·溶液2 mL，立即混勻，在避光處保存30 min，以無水乙醇溶液作為參比溶液，在波長為517 nm處測定吸光度（Ai）;用無水乙醇溶液代替DPPH·溶液，測定吸光度（Aj）;用無水乙醇溶液代替豌豆蛋白溶液測定吸光度（A0）。清除率計算公式：

清除率=A0-（Ai-Aj）A0×100%（1）

1.3.6.2 超氧陰離子自由基

（O2·-）清除率的測定。采用鄰苯三酚法[9]：4.5 mL Tris-HCl和3.3 mL蒸餾水混勻后，25 ℃下保持20 min后加入0.9 mL提取液和0.3 mL鄰苯三酚溶液，混勻后倒入比色皿，以10 mmol/L的HCl作參比溶液，在波長為320 nm處，每30 s測定吸光度，計算4 min內平均每分鐘吸光度的增加A2，并計算不加樣品的對照組的吸光度A1。清除率計算公式：

清除率=A1-A2A1×100%（2）

1.3.6.3 還原力測定。參考Benzie等[10]的方法：1 mL蛋白質提取液中加入2.5 mL pH為6.6的0.2 mol/L磷酸緩沖液（PBS），50 ℃水浴20 min，快速冷卻后加入2.5 mL質量分數為10%的三氯乙酸（TCA）溶液，3 000 r/min離心10 min后取上清液2.5 mL，再加入2.5 mL蒸餾水、0.5 mL質量分數為0.1%的FeCl3溶液，混合均勻，于10 min后以蒸餾水作為參比液，波長700 nm處測定吸光度（A），并測定不加樣品的對照組的吸光度（A0）。還原力計算公式：

還原力=A-A0 （3）

1.3.6.4 羥自由基（·OH）清除率的測定。參考水楊酸法[11]，并作相應改動：蛋白質提取液1 mL，加入FeSO4溶液、水楊酸-乙醇溶液和H2O2溶液各1 mL，37 ℃下保持30 min后離心，以蒸餾水作參比溶液，510 nm波長處測定吸光度（Ai），用蒸餾水溶液代替H2O2溶液，測定吸光度（Aj）;用蒸餾水代替提取液測定吸光度（A0）。清除率計算公式：

清除率=A0-（Ai-Aj）A0×100%（4）

1.4 數據統計分析 采用Microsoft Excel 2007、Design Expert 8.0.6軟件進行數據處理、分析及繪圖。

2 結果與分析

2.1 豌豆基礎成分的測定結果 豌豆中水分含量為912%，蛋白質含量為20.60%。

2.2 單因素試驗

2.2.1 料液比對豌豆蛋白提取率的影響。由圖1可知，隨著料液比的不斷減小，蛋白質提取率不斷增大，當料液比在1∶30時，提取率達到最大，主要是由于溶劑與樣品接觸面濃度差變大，引起滲透壓增大，更有利于溶質的滲出，最終得到蛋白質提取率不斷升高的現象[12];隨后料液比減小，提取率下降，主要是由于隨著料液比的不斷減小，提取液中蛋白質濃度降低，增加了蛋白質的提取難度。因此，選擇料液比1∶25、1∶30、1∶35進行響應面優化試驗。

2.2.2 提取時間對豌豆蛋白提取率的影響。由圖2可知，隨著提取時間的增加，蛋白質提取率呈先上升后下降的變化趨勢，在提取時間為50 min時，蛋白質提取率達到最大。主要由于提取時間增加，溶質的溶解度逐漸增大，酶與蛋白質充分反應，當達到一定時間后，溶質的溶解度達到最大，且酶活性降低，進而蛋白質的提取達到最大限度，不再溶出蛋白質[13]。因此，選擇提取時間40、50、60 min進行響應面優化試驗。

2.2.3 提取次數對豌豆蛋白提取率的影響。由圖3可知，提取次數不同豌豆蛋白提取率不同，隨著提取次數的增加，豌豆蛋白提取率呈上升趨勢，當次數在1～3時，提取率上升趨勢明顯，之后繼續增加提取次數，提取率雖有上升，但是幅度很小，這主要是由于前期已經將大部分蛋白質提取出來，后期繼續提取效果已不明顯，反而會增加時間和試劑的消耗，因此，選擇提取2、3和4次進行響應面優化試驗。

2.2.4 超聲波功率對豌豆蛋白提取率的影響。由圖4可知，隨著超聲波功率的增大，豌豆蛋白提取率先增加后下降，在超聲波功率為150 W時，提取率達到最大。這是因為超聲波的功率增加，其空化效應和機械效應就愈加明顯，作用更加強烈，將植物細胞壁進一步破碎，增大蛋白質溶出速率，進而使蛋白質更易溶出。但超聲波功率大于150 W后，超聲波作用則會引起蛋白質的變性，最終會影響蛋白質提取率[14]。因此，選擇超聲波功率120、150和180 W進行響應面優化試驗。

2.3 響應面試驗

2.3.1 響應面試驗設計及結果。在單因素試驗結果基礎上，以豌豆蛋白提取率為響應值（Y），以料液比（A）、提取時間（B）、提取次數（C）、超聲波功率（D）為自變量，應用Design Expert8.0.6統計分析軟件設計試驗方案，結果如表2所示。

2.3.2 回歸模型擬合及方差分析。利用統計軟件對表2數據進行多元回歸擬合，得到提取率（Y）與自變量之間的回歸方程，即：

分析可知，回歸模型P<0.01，表明該回歸模型極顯著;模型的R2=0.962 5，表明模型的擬合值與實際結果的相關性較高;失擬項不顯著（P>0.05），說明回歸方程擬合較好，模型穩定;變異系數CV=4.69%<10.00%，進一步說明模型擬合較好，可用來進行分析和預測。

由F可知，4個因素對響應值影響的大小順序A>B >C>D，其中，一次項A和交互項AB，以及二次項A2、B2、C2、D2對響應值的影響極顯著（P<0.01），一次項B和交互項AC、AD對響應值的影響顯著（P<0.05）。

2.3.3 響應面分析。兩因素之間的交互作用對響應值的影響可以通過響應面圖反映出來，響應曲面坡度越陡峭，說明因素改變對于響應值的影響越大，而曲面坡度越平滑，說明因素改變對響應值的影響也就越小[15]。圖5為料液比與提取時間、料液比與提取次數、料液比與超聲波功率、提取時間與提取次數、提取時間與超聲波功率、提取次數與超聲波功率之間交互作用對豌豆蛋白提取率的影響。從圖中可以看出，圖5a曲面坡度最陡峭，圖5b和圖5c曲面坡度較陡峭，而圖5d、圖5e和圖5f曲面坡度較平滑，說明料液比與提取時間的交互作用對豌豆蛋白提取率的影響最明顯，其次是料液比與提取次數的交互作用、料液比與超聲波功率的交互作用的影響，而提取時間與提取次數、提取時間與超聲波功率、提取次數與超聲波功率的交互作用對豌豆蛋白提取率的影響不明顯，此結果與方差分析結果一致。

2.3.4 驗證試驗。對回歸方程進行分析求解，得豌豆蛋白提取率達到最大值時的提取條件為料液比1∶30.51，提取次數3.1次，提取時間50.22 min，超聲波功率150.98 W，此條件下的提取率預測值為95.04%。為方便試驗操作，將提取條件定為料液比1∶30，提取次數3次，提取時間50 min，超聲波功率150 W，在此條件下進行驗證試驗，得豌豆蛋白提取率為95.64%，預測誤差為0.63%，與預測值接近。說明此模型可以用于豌豆蛋白提取條件的分析預測，響應面法也可以有效優化豌豆蛋白提取工藝條件。

2.4 抗氧化活性試驗

2.4.1 DPPH·清除率測定結果。DPPH·是一種很穩定的氮中心的自由基，它的無水乙醇溶液呈紫色，在517 nm波長處有最大吸收，吸光度與濃度呈線性關系，向其中加入自由基清除劑時，可以結合或替代DPPH·，使自由基數量減少，吸光度變小，溶液顏色變淺，進而可評價其清除自由基的能力[16]。豌豆蛋白提取物對DPPH·的清除能力如圖6所示，由圖中可以看出，DPPH·清除率呈現先上升后下降的趨勢，當豌豆蛋白提取物濃度為1%～3%時，隨著濃度的升高，DPPH·清除率上升，當濃度達3%時，DPPH·清除率達到最大值51.5%。之后隨著濃度的下降， DPPH·清除率也下降。說明豌豆蛋白具有一定的清除DPPH·自由基的作用，且最佳清除濃度為3%。

2.4.2 超氧陰離子自由基（O2·-）清除率測定結果。O2·-在水溶液中不太活潑，但其質子化形式HOO·比較活潑，它可以啟動脂質過氧化反應，并能和GSH反應。細胞膜表面的微酸性環境非常利于HOO·的生成，HOO·的穿透性很強，容易引起細胞膜深層及細胞內物質的損傷[17]。因此，通過測定O2·-的清除率可判斷物質抗氧化能力的強弱。豌豆蛋白提取物對O2·-的清除率如圖7所示，從圖中可以看出，O2·-的清除率呈現先上升后下降的趨勢。當提取物濃度為1%～3%時，O2·-清除率隨提取物濃度的增加而升高，當提取物濃度達3%時，O2·-清除率達到最大值54.5%，之后當濃度為3%～5%時，清除率逐漸下降。結果表明豌豆蛋白具有一定清除O2·-的作用，且最佳清除濃度為3%。

2.4.3 還原力測定結果。由圖8可知，在1%～3%內，隨著濃度的增加，吸光度增大，還原力也增大，這是因為當提取物濃度增大時，和堿性蛋白酶接觸并反應得更加充分，其還原力也隨著提取物濃度的增大而增大，當提取物濃度為3%時，吸光度最大，即還原力最大，但在3%～5%內，提取物濃度繼續增大，吸光度逐漸變小，還原力也變小，主要是因為當提取物濃度增大到一定程度時，會抑制酶促反應的進行[18]，因此，其還原力最強的濃度為3%。

2.4.4 ?羥自由基（·OH）測定結果。·OH是已知的氧自由基中最強的氧化劑，它可以啟動脂質過氧化反應，幾乎可以和所有的細胞成分發生反應，對機體的危害極大[19]。因此，通過測定物質清除·OH的能力可以判斷物質抗氧化能力的強弱。由圖9可以看出，豌豆蛋白提取物對·OH的清除能力隨濃度增加呈先上升后下降趨勢，即在濃度為1%～3%時，清除率逐漸上升，濃度達3%時，清除率達到最高點56.3%，之后當濃度為3%～5%時，清除率逐漸下降，此結果表明，豌豆蛋白具有一定的清除·OH的能力，且清除效果最佳的濃度為3%。

3 結論

該研究采用超聲輔酶法從豌豆中提取豌豆蛋白，在單因素試驗的基礎上，應用響應面分析法優化豌豆蛋白的提取工藝，并得到豌豆蛋白提取的最佳工藝條件為料液比1∶30（g∶mL），提取次數3次，提取時間50 min，超聲波功率150 W，在此條件下得豌豆蛋白提取率為95.64%，預測值為95.04%，預測誤差為0.63%，說明采用響應面方法優化豌豆蛋白提取工藝可行，此結果為今后對豌豆蛋白的進一步研究奠定了理論基礎。

抗氧化活性試驗結果表明，豌豆蛋白具有一定的抗氧化能力，其中，對DPPH·、O2·-和·OH的最大清除率分別為51.5%、54.5%、56.3%，最大還原力為0.54，此結果可為豌豆蛋白在食品及醫藥保健品等領域的開發利用提供一定的借鑒。

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