美國白蛾熱激蛋白家族基因的篩選與鑒定

楊廣生　張蘭　張猛　陳琪

摘 要：熱激蛋白（Heat shock protein，HSP）一般是指生物體遇到極端環境時大量表達的一類高度保守基因，在昆蟲的抗逆性反應中發揮重要作用。以世界性入侵害蟲美國白蛾（Hyphantria cunea）基因組數據為依據，對白蛾的HSP家族基因進行篩選與鑒定。結果表明：美國白蛾體內共有20個HcunHSPs，包括8個HSP20s、7個HSP40s、4個HSP70s和1個HSP90;結合美國白蛾12個轉錄組中上述HSPs的表達量及鱗翅目中已有相關基因的功能研究，對HcunHSPs功能進行了初步預測。研究結果可為后期對美國白蛾抵抗逆境脅迫機制研究提供分子理論基礎，為針對美國白蛾的綠色防控提供基因靶標和新思路。

關鍵詞：美國白蛾;熱激蛋白;基因組;轉錄組

中圖分類號 S763.42文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0010-04

熱激蛋白（HSP）又名應激蛋白或分子伴侶，廣泛分布于真原核生物中，通常在細胞或生物體遇到極端環境如高溫、寒冷、缺氧、UV輻射、擁擠、傷口愈合和組織重建時發揮作用[1-4]。根據HSP在生物體內的表達情況可被分為組成型HSP和誘導型HSP[5]。前者在生物體常態即大量表達，對外界脅迫不敏感，主要參與生物體的生長發育;后者常作為分子伴侶發揮作用，通常情況下不表達或低表達。在昆蟲中，當蟲體遇到脅迫刺激時，誘導型HSP可通過上調表達量，與異常蛋白結合幫其重新折疊，避免細胞內蛋白質損傷嚴重，從而起到保護昆蟲免受環境刺激的影響。目前最被相關學者認可的是根據熱激蛋白的分子量（kDa）大小進行分類，一般可被分為HSP90、HSP70、HSP60以及小分子熱激蛋白（small heat shock protein，sHSP，蛋白質分子量低于50kDa的熱激蛋白，常包括HSP20、HSP40）等4類[6]。

美國白蛾（Hyphantria cunea），又名秋幕毛蟲、秋幕蛾，隸屬鱗翅目（Lepidoptera）、燈蛾科（Arctiidae）、白蛾屬（Hyphantria），是一種取食范圍極廣的世界性重要入侵害蟲，其大量暴發時受害樹木部分樹冠被網幕覆蓋，樹葉全部被食光，可對森林生態系統造成毀滅性破壞。目前，美國白蛾的基因組和不同組織與齡期的轉錄組數據已經公布，為本次研究提供了有利基礎。

筆者借助美國白蛾基因組的基因注釋信息和NCBI-Blastp，對其熱激蛋白家族基因進行了篩選與鑒定，并結合不同組織和齡期中熱激蛋白基因的表達量變化對其功能進行初步分析。通過對美國白蛾體內熱激蛋白的篩選與鑒定，為后期研究美國白蛾適應環境變化及應對極端環境的分子機制提供理論基礎，為開發綠色防控基因靶標提供新思路。

1 材料與方法

1.1 研究材料 主要利用美國白蛾基因組和12個不同齡期和組織的轉錄組測序數據[7]，包括：（1）不同齡期：卵、2齡幼蟲、4齡幼蟲、蛹以及雌雄全蟲;（2）不同組織：頭、胸、腿、腹、觸角和雌蟲性腺。轉錄組數據主要利用美國白蛾熱激蛋白家族基因在12個轉錄組樣本的表達量數據FPKM（fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped）。

1.2 研究方法

1.2.1 美國白蛾HSP家族基因篩選 借助美國白蛾已發表的基因組注釋信息[7]，以Heat shock protein和HSP作為關鍵詞檢索相關基因信息，并在基因組測序結果中將對應基因的核苷酸序列整理出來。利用在線翻譯工具ExPASy（https：//web.expasy.org/translate/）將初篩得到的美國白蛾HSP家族基因核苷酸序列翻譯為氨基酸。

1.2.2 美國白蛾HSP家族基因鑒定 利用NCBI中的Blast對在基因組中初篩得到的HcunHSPs家族基因的氨基酸進行在線同源比對，查看Query cover和Ident值均較高的基因序列信息，對美國白蛾HSP家族基因進行進一步鑒定。其中Query cover表示所比對序列與目標序列的覆蓋度，Ident表示所比對序列與目標序列的相似度。兩者均以百分比表示，百分數越大，基因之間相似度越高。

1.2.3 美國白蛾HSP家族基因功能初步預測 借助美國白蛾12個不同齡期與組織的基因表達信息FPKM值[7]，比較美國白蛾HSPs家族基因在樣本中的表達情況，關聯該時期或組織的功能特點，并結合國內外關于該HSP已有功能研究，對美國白蛾HSPs的功能進行初步預測。

2 結果與分析

2.1 美國白蛾HSP家族基因 在美國白蛾基因組注釋信息中，共篩選到29條與HSP相關的序列信息，其中有9條為不符合篩選目的的序列，包括HSP-binding protein、分子量大小不符合以及經過NCBI-Blast后同源性極低的序列。經過濾不符合要求的信息后，共獲得20個美國白蛾HcunHSP家族基因（見表1），包括：8個HSP20s、7個HSP40s、4個HSP70s和1個HSP90。此外，鑒定得到的HcunHSP70中，有3個HcunHSP70（Gene ID分別為：EVM0013579、EVM0003299、EVM0000698）均包含已報道的HSP70特有序列IDLGTTYS、IFDLGGGTFDVSIL、VVLVGGSTRIP[5]。HcunHSP90（Genen ID：EVM0012516）包含了YSNKEIFLRE、LGTIAKSGT、IKLYVRRVFI、GVVDSEDLPLNISR 4條HSP90特有序列[5]。7個HcunHSP40基因均為DnaJ homolog，且均與家蠶（Bombyx mori）的BmorDnaJ （HSP40）同源性匹配度高，除了EVM0001102（與BmorDnaJ （HSP40）homolog 9比對結果覆蓋度達 99%），其他6個HcunHSP40與家蠶不同的BmorDnaJ （HSP40）的NCBI-Blast比對結果中的覆蓋度均達到了100%（見表1），相似度極高。研究表明HSP20保守性較差，所以8個HcunHSP20在NCBI中比對結果相對于其他HcunHSPs的同源比對結果中，覆蓋度和相似度偏低，但仍具有一定的相似性。

2.2 美國白蛾HSP家族基因的表達量及功能 借助美國白蛾12個樣本的轉錄組測序結果中美國白蛾HSP家族基因的表達量（FPKM）信息（見表2、3），結果顯示相同HcunHSP在不同樣本和不同HcunHSPs在相同樣本中的表達差異均很大。

在HcunHSP20s中，基因EVM0013517與EVM0003954在不同齡期中的表達趨勢相似，均在雌成蟲中表達量最高，但在不同組織中，兩者分別在胸部組織和性腺中表達量最高。異色瓢蟲中（Harmonia axyrides）的HaxyHSP21.53也是在成蟲期表達量達到最高，在瓢蟲生長發育中發揮重要作用[8]，因此推測HcunHSP20中的上述2個基因可能也與美國白蛾的生長發育具有重要聯系，且EVM0003954主要在雌成蟲性腺中表達，可能對性腺功能有重要影響，推測屬于組成型HSP，或可應用于美國白蛾防治的基因靶點。現有研究一般認為HSP20主要作為昆蟲應對高溫脅迫時發揮響應的分子伴侶，如抑制紅尾肉蠅（Sarrcophaga crassipalpis）的HSP23表達會降低其非滯育蛹的耐熱性[9]。

在HcunHSP40s中，EVM0002427和EVM0010789在卵塊中表達量較高，可能參與美國白蛾卵的抗性反應;EVM0001102在成蟲期表達較高，且在不同組織中表達差異不大。HSP40目前被證實在昆蟲遇到缺氧刺激時可參與維持細胞中蛋白質穩態，主要作為幫助蛋白質折疊的分子伴侶。也有研究發現HSP40參與家蟋蟀落翅型翅二型的分化[10]。研究篩選得到的HcunHSP40s與鱗翅目中模式昆蟲家蠶的BmorHSP40s的同源性較高，推測其功能可能與其相似，可能參與美國白蛾的抗逆和抗病過程[11]。

在HcunHSP70中，EVM0013579在12個樣本中均未檢測到表達，推測該基因可能不表達或響應極端環境刺激才會有所表達，與草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）SfruHSP70同源性較高，而研究表明SfruHSP70參與ATP-binding（https：//www.uniprot.org/uniprot/Q8I866）;EVM0003299基因僅在美國白蛾卵塊和觸角中檢測到表達，但表達量均比較低，該基因與斜紋夜蛾（Spodoptera litura）的SlitHSP70同源性較高，研究表明SlitHSP70響應鋅脅迫[12]。EVM0000698僅在美國白蛾腹部中有表達且不高，該基因也與SlitHSP70具同源性（見表1），在S. litura中，SlitHSP70在中腸中表達，但在脂肪體中表達量最高。上述3個基因是檢測到3條HSP70特有序列的3個基因，是典型的HSP70。EVM0001158在不同齡期和組織中表達量差異不大，推測該基因表達于美國白蛾線粒體中，現有研究表明線粒體熱激蛋白主要參ATP-binding和Nucleotide-binding。

在HcunHSP90中，EVM0012516在不同齡期和組織中均有表達，且在卵中表達量最高（FPKM=1232.52832）。HSP90被認為是真原核生物中含量豐富的蛋白之一，無論是否遇到脅迫，都是真核生物必不可少的蛋白[13]，可見HSP90功能強大且廣泛，而HcunHSP90與黃野螟（Heortia vitessoides）HvitHSP90同源性最高，但HvitHSP90功能研究較少。在鱗翅目昆蟲中，HSP90主要參與昆蟲的生長發育、滯育和抗病過程[11]。因此，推測HcunHSP90也與美國白蛾的相應功能有關。

3 小結

熱激蛋白一直是真原核生物中關注的熱點基因。在昆蟲中，因其在不同物種中的高度保守性，已成為分析物種進化的重要參考;因其響應環境刺激表達量快速上調，已成為環境監測工作中常用指標;因其主要參與昆蟲抗逆反應，通過抑制HSP表達可降低蟲體的抗逆性從而達到防治害蟲的目的。美國白蛾作為一種危害性強而廣的世界入侵害蟲，從其HSP基因入手，將為研發綠色有效的監測和防控新手段提供基因靶標。研究篩選得到的HSP20（EVM0003954）、HSP40s（EVM0002427和EVM0010789）、HSP70（EVM0001158）、HSP90（EVM0012516），將可為后期的相關研究提供重要的分子理論研究基礎。

參考文獻

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（責編：徐世紅）