利用分子標記及花藥培養快速改良五山絲苗

徐麗媛　周桂林　馮睿彤　范家萌　周賢達　周紅英　吳曉亮

摘 要：將五山絲苗/R0356作為親本，使用分子標記輔助育種和水稻花藥培養相結合的方法，僅需2年即得到穩定遺傳的與五山絲苗性狀相似且帶有香味的恢復系材料。具體方法是通過分子標記檢測F2代材料，確定單株材料中是否含有香味基因，對含有香味基因的單株在孕穗期取樣進行水稻花藥培養，培養過程使用的誘導培養基為M8+2.0mg/L 2，4-D+1.0mg/L KT+60g/L蔗糖+8g/L瓊脂，花藥培養得到的純合二倍體綠苗再進行分子標記檢測，將含有香味基因的材料在田間種植，經過篩選后即得到優質的改良五山絲苗（HPR10）。

關鍵詞：分子標記檢測;花藥培養;恢復系選擇;香味

中圖分類號 S511文獻標識碼 A文章編號 1007-7731（2020）12-0014-03

Abstract： With the combination of molecular marker assisted breeding and rice anther culture， it takes only 2 years to get the restorer line materials with stable genetic characteristics similar to wushansimiao / r0356 as parents. The specific method is to detect F2 generation materials by molecular markers to determine whether there is fragrance gene in the single plant materials. The single plant with fragrance gene is sampled at booting stage for rice anther culture， and the induction medium used in the culture process is M8+2.0mg/l 2，4-D+1.0mg/l KT+60g/L sucrose+8g/L agar， The pure diploid green plantlets obtained from anther culture were detected by molecular markers， and the materials containing fragrance genes were planted and propagated in the field. After screening， the high quality improved wushansimiao（hpr10） were obtained.

Key words： Molecular marker detection; Anther culture; Restoration line selection; Fragrance

中國是世界上最大的水稻生產和消費國，雜交水稻的成功選育，為保障國家糧食安全供給做出了巨大的貢獻[1]。近年來，隨著生活質量的提高，國民對稻米食味品質的需求有所提高，給育種工作帶來了新的機遇和挑戰[2]。

傳統的育種手段對優質材料的純化效率偏低，1個材料需要4～5年才能選育出純合材料。水稻花藥培養技術利用花藥誘導愈傷分化獲得單倍體綠苗，單倍體綠苗DNA加倍后即得到純合二倍體材料，這種方法能夠縮短育種時間，加快育種速度。但在實際操作過程中，有很多因素影響培養效果[3-4]。

作為高品質稻米的一個重要特性，含有香味特性的稻米更受市場青睞。在稻米香味的選育過程中，直接有效的方式是對水稻香味基因進行檢測?，F在水稻全基因組序列已經明確，香味功能基因的分子標記已經比較成熟[6-7]。通過分析得到與香味基因緊密連鎖的分子標記基因，可以直接進行檢測[8]。在其他農藝性狀不變的前提下對恢復系進行改良，變成食味品質更佳的材料，對于推動農業高質量發展具有重要的意義[9]

本研究對恢復系進行了快速改良，將分子標記輔助選擇、水稻花藥培養技術與傳統的育種手段結合，在育種的低世代獲得含有目的基因的純合材料，以期縮短育種周期，提高育種效率[10]。

1 材料與方法

1.1 供試材料 供試材料：五山絲苗、R0356。五山絲苗的株型較緊湊、抗倒力中強、成穗率高;R0356的株高較高、劍葉挺、粒型細長、含有香味，但莖稈較細，抗倒性弱。所有材料均由合肥豐樂種業股份有限公司水稻研究院提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 分子標記檢測 水稻苗期，在田間取葉片進行檢測，使用DNA快速提取方法獲取樣品DNA溶液[11]。多態性標記引物GRFM04[12]序列為F：GTTAGGTTGCATTTACTGGGAG，R：GAATGATGCTCAA AGTGTCT，擴增體系為：DNA提取液2.0μL、10 x Buffer 1.0μL、dNTP 0.8μL、引物0.5μL、Taq酶0.1μL和ddH2O 5.6μL。PCR反應程序為：94℃預變性2min;35個循環：①變性94℃，15s，②退火55℃，15s，③延伸72℃，30s;72℃延伸5min，4℃保存。PCR擴增產物使用4%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳檢測。

1.2.2 水稻花藥培養 取材時選擇處在單核靠邊期的花粉，目測處于水稻劍葉與倒二葉葉枕距5～8cm時，接種過程使用剪穎抖藥法。培養過程采用3步培養法：誘導培養時以M8為基本培養基，配合多種激素，具體激素添加量如表1所示;分化培養時以MS為基本培養基;生根培養時以1/2MS為基本培養基。培養基pH均為5.8。

1.3 選育過程 2017年8月，豐樂種業蘇小水稻基地利用五山絲苗/R0356構建群體，同年12月，海南種植BC1F1群體，去除假雜種，其余種子混合收獲。2018年5月，在F2代中選取3個較好的株系命名為CR1、CR2、CR3，每個株系群體種植1000株，苗期取單株葉片進行基因檢測分析，對檢測到含有香味基因的材料進行花藥培養得到H0代幼苗，同年12月將培養出的H0代幼苗移栽至三亞種植。田間種植后，對結實較好的正常苗進行取材，寄回合肥進行香味基因的檢測，收獲含有香味基因的H1代材料單穗。2019年5月，在合肥種植H1，并進行配合力測定。2019年12月進行了三亞比較試驗，篩選得到符合目標性狀的H2代株系并進行選擇和進一步利用。選育流程如圖1所示。[2017年08月 五山絲苗/R0356 合肥-構建群體

2017年12月 F1 三亞-去假雜種，混收2018年5月 F2 合肥-種植群體，選取三個較好的株系，單株檢測，花藥培養2018年12月 H0 三亞-種植花培苗，檢測香味基因，單穗收2019年5月 H1 合肥-株行種植，配合力測定2019年12月 H2 三亞-篩選、利用 ]

2 結果與分析

2.1 改良群體分子標記檢測結果 對每個群體所有單株（共1000個）進行檢測，CR1、CR2、CR3分別得到137、164、121個含有香味基因的單株，部分分子檢測電泳圖譜見圖2。圖2所示為CR1株系1-90號單株檢測電泳圖譜，其中CK為含有目的基因的條帶。由圖2可知，CR1材料1～90號單株中，有14個單株的帶型與CK帶型相同，分別為3、7、10、21、25、31、37、38、39、56、57、58、59、60。將這些編號的材料在田間找出并標注，在合適時期取材進行花藥培養。

2.2 影響水稻花藥培養的因素 水稻花藥培養過程中，愈傷組織誘導率受取材時間和誘導培養基配方2個因素的影響較大。

2.2.1 不同取材時間對誘導效果的影響 愈傷組織生成數統計日期為轉接花藥后第75天，轉接花藥數目統計按照每個單株轉接2瓶，每瓶轉接50枚花藥計算。通過表中的數據可以看到，不同取材時間的誘導率不同，CR1在7月27日取材時誘導率最低，隨后逐漸上升，8月16日取材時誘導效率最高，CR2在7月27日所取材料得到最高的誘導率，隨后逐漸降低，CR3在7月27日和8月16日取材的誘導率較低，8月6日取材的誘導率最高。由于不能對每個細胞都進行鏡檢，不同材料的單株狀態并不完全相同，同一株系內水稻單株又具有不同的分蘗。經過試驗發現，需要多次對同一材料進行田間取材，才能夠得到較高的誘導率。

2.2.2 不同激素對誘導花藥愈傷組織效果的影響 從圖3可以看出，3種配方誘導產生的愈傷組織個數，培養基B在3個材料上均表現出低誘導率，培養基C在3個材料上均表現出高誘導率，因此在培養過程中使用培養基C進行培養能夠獲得更多的愈傷組織。

2.3 改良效果 經過花藥培養，共生成330株綠苗，將綠苗從培養基中取出，洗凈根系后移栽種植。移栽到大田時用遮陽網蓋住，防止弱苗被陽光直射導致死苗，7d后綠苗葉片舒展，施少許復合肥使其快速生長，根據綠苗長勢選擇需要的單株，將未加倍的單倍體、結實差和農藝性狀不好的單株去除，留取符合育種目標的單株進行單穗收獲，第2季將單穗進行株行種植，后期進一步觀察。目前，通過該技術選擇得到30個含有香味的穩定株系，經過一系列田間比較試驗，最終篩選得到優質改良恢復系HPR10。該材料與五山絲苗相似，但導入了R0356的香味基因，含有香味，配合力更好、株高適中、分蘗強、抗倒性較強。

3 討論

由于秈稻花藥培養誘導率的高低受基因型的影響較大，針對不同材料需找到適合的培養方法。由于愈傷誘導后期的分化培養階段均使用常規MS培養基，本文僅對誘導愈傷組織階段培養基進行改良，通過試驗得到了一種對該材料實用性較高的配方，并且采取一個株系多次取材的方法，保證材料其有較高的愈傷組織誘導率。

由于當前分子標記檢測的費用較低，且操作簡便，可對所有需要檢測的材料都進行檢測。本試驗經檢測結果僅有14%的單株含有香味基因，通過檢測增加了選取材料的精確度，減輕了田間育種工作量。

與其他育種材料相比，改良恢復系的可利用價值更高，分子生物學和細胞生物學的快速發展，為育種單位縮短育種年限、提高育種效率提供了切實可行的途徑。本研究針對性的將田間育種、分子標記輔助選擇、水稻花藥培養3種方法進行結合，充分利用現代科技手段，快速改良恢復系并得到了預期材料。

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（責編：張宏民）