慢病毒介導Napsin A 基因對非小細胞肺癌細胞生物學功能的影響

范莎，王露，王婷

長治醫學院附屬和濟醫院呼吸內科，山西 長治 046000

非小細胞肺癌在原發性肺癌中約占80%，是呼吸系統最常見的惡性腫瘤，發現時一般處于中晚期，錯過最佳治療時期，預后較差，因此尋求特異性指標一直是臨床工作者和相關科研工作者探求的重點[1]。Napsin A基因于20世紀90年代被Tatnell等[2]發現并報道，認為其屬于天冬門氨酸蛋白酶家族；后來隨著研究的不斷深入發現Napsin A基因可參與脾、腎和肺等臟器的發育，在肺部研究中發現其主要通過介導肺表面活性物質合成促進肺成熟[3-4]。隨后，Ezzat和 Tahoun[5]、沈維敏等[6]發現Napsin A基因在正常肺組織、異常Ⅱ型肺泡上皮細胞和肺腺癌中均有表達，并且發現其與腫瘤細胞的惡性程度呈負相關，提示Napsin A基因與肺癌的發生及發展可能相關，但關于其在非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌中的表達及意義較少報道。本研究首先通過實時熒光定量聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）檢測法從組織水平分析Napsin A基因在非小細胞肺腺癌/鱗狀細胞癌組織中的表達及差異，后構建shRNA-Napsin A重組慢病毒分別轉染A549/H1703細胞株，并采用CCK-8法、流式細胞儀和Transwell法分別檢測其增殖、凋亡及侵襲能力，從細胞水平探討Napsin A基因在非小細胞肺腺癌/鱗狀細胞癌中的作用，為非小細胞肺癌患者的個體化診療提供依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2016年2月至2018年3月于長治醫學院附屬和濟醫院診療并經病理學檢查確診為原發性非小細胞肺癌的74例患者作為研究對象，其中鱗狀細胞癌56例，腺癌18例。鱗狀細胞癌患者中，男40例，女16例；平均年齡（42.18±6.35）歲；組織學分化：低分化18例，中高分化38例；淋巴結轉移20例。腺癌患者中，男13例，女5例；平均年齡（43.22±6.07）歲；組織學分化：低分化6例，中高分化12例；淋巴結轉移8例。鱗狀細胞癌和腺癌患者性別、年齡、組織學分化、淋巴結轉移等基線特征比較，差異均無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。分別選取74例非小細胞肺癌患者的癌組織和癌旁正常組織標本。所有研究對象均對本研究知情并簽署知情同意書，本研究經過醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞、試劑及儀器

非小細胞腺癌和鱗狀細胞癌細胞株（A549/H1703）均購自中科院上海細胞研究所，于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養。針對Napsin A基因設計shRNA-Napsin A構建重組慢病毒pLentshRNA-Napsin A，針對陰性對照序列設計shRNAControl構建重組慢病毒pLent-shRNA-Control，以上均由山東維真生物科技有限公司設計并合成。氨芐青霉素溶液（100 mg/ml）購自北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養基、10%胎牛血清和0.25%胰蛋白酶均購自美國Sigma公司；RNA抽提試劑Trizol和轉染試劑Lipofectamine 2000均購自美國Invitrogen公司；CCK-8試劑盒和細胞凋亡檢測試劑盒均購自上海翊圣生物科技有限公司；Transwell小室（含機制）購自美國Corning公司。CFX96實時熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；Cyto-FLEX流式細胞儀購自美國beckman公司；GENESYSTM180紫外分光光度儀購自美國Thermo Fisher公司；DNM-9606酶標分析儀購自北京普朗新技術有限公司。

1.3 細胞分組

將A549/H1703兩類細胞均分為三組，shRNANapsin A組：重組慢病毒pLent-shRNA-Napsin A轉染 A549/H1703；shRNA-Control組：重組慢病毒pLent-shRNA-Control轉染 A549/H1703；空白對照組：無任何處理的A549/H1703。

1.4 實時熒光定量PCR法檢測Napsin AmRNA表達水平

提取總RNA：參考Trizol試劑盒完成組織或細胞中總RNA的提取，分為裂解-抽提-漂洗-洗脫四步，后將其保存于TE緩沖液（由Tris和EDTA配制，用于保存核酸）中，并測定其A260和A280的光密度（optical density，OD）值，A260/A280比值為1.6～1.8為合格，可繼續后續實驗。獲取cDNA：參考逆轉錄M-MLV試劑盒操作說明書完成cDNA制備，簡單分為cDNA第一鏈合成-雙鏈cDNA合成-連接-轉化-目的cDNA克隆鑒定。實時定量PCR檢測：在本研究中對照序列為β-actin，分別備好檢測樣本和對照序列反應體系（50 μl），具體包括 10 μl SYBR Green染料、各0.5 μl上下游引物（0.5 μmol/L）、0.5 μl dNTP 混合液（200 μmol/L）、1.0 μl TaqDNA聚合酶（5 U）、5 μl DNA 模板和 32.5 μl ddH2O，充分混勻并置于6000 r/min瞬時離心，后將兩者同時上機進行檢測，反應條件為93℃10 min、95℃30 s、60℃ 1 min、72℃ 1 min，共40個循環，最后72℃10 min終末延伸，獲取Ct值，以2-△△Ct表示Napsin ARNA相對表達水平。

1.5 CCK-8法檢測細胞增殖能力

參考CCK-8試劑盒完成以下步驟：①接種，慢病毒成功轉染A549/H1703兩類細胞后，取對數生長期的各組細胞，重懸并調整細胞濃度，后將其接種于96孔板上（每孔約1×103個細胞），每組設置5個平行孔；②培養，將接種板置于37℃、5%CO2、飽和濕度培養箱中培養；③終止，共培養5天，并于每天同一個時間點向各孔中加入CCK-8溶液，后將其置于培養箱再培養4 h；④測定及分析，4 h后將其取出置于酶標儀上，于450 nm波長測定各孔OD值，分析各組OD值水平以代表其增殖能力。實驗重復3次，取均值。

1.6 流式細胞儀檢測細胞凋亡能力

①細胞重懸，慢病毒成功轉染A549/H1703兩類細胞后，取對數生長期的各組細胞，3000 r/min離心棄上清，后加入細胞重懸液；②添加熒光標記試劑，向A549/H1703各組重懸細胞中依次加入膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-fluorescein isothiocyanate，Annexin V-FITC）和碘化丙啶（propidium iodide，PI），充分混勻，常溫避光靜置15 min；③上機及分析，各組細胞共培養5天，并于每天同一個時間點完成以上操作，最后將其進行上機檢測，分析各組凋亡細胞情況并計算出凋亡率（凋亡細胞/細胞總數×100%）。實驗重復3次，取均值。

1.7 Transwell 實驗檢測細胞侵襲能力

①慢病毒成功轉染A549/H1703兩類細胞后，取對數生長期的各組細胞，重懸細胞并調整至4×106/ml；②Transwell小室制備，貼8 μm膜；③分別向上下室加入200 μl各組細胞和600 μl完全培養液，繼續培養，共培養5天，分別于每天同一個時間點用棉簽抹去上室留存細胞后進行蘇木精-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色，清洗，待其自然干燥后于倒置顯微鏡下觀察并計數侵入下室細胞個數，取5個視野細胞平均值。實驗重復3次，取均值。

1.8 統計學方法

采用SPSS 19.0統計學軟件分析數據：計量資料以均數±標準差（±s）表示，采用Kolmogorov-Smirnov法進行正態性檢驗，Levene法進行方差齊性檢驗，多組比較采用One-way ANOVA方差分析，多組內兩兩比較采用LSD-t檢驗；以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌組織和細胞中Napsin AmRNA 表達水平的比較

與非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌癌旁正常組織（[0.85±0.14）、（0.88±0.17）]比較，非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌組織（[4.15±0.46）、（1.93±0.34）]中Napsin AmRNA表達水平均明顯升高，且腺癌中Napsin AmRNA表達水平明顯高于鱗狀細胞癌，差異均有統計學意義（t=29.118、20.670、22.035，P=0.000）；A549細胞株中Napsin AmRNA表達水平為（4.28±0.51），明顯高于H1703細胞株的（1.85±0.23），差異有統計學意義（t=12.285，P=0.000）。

2.2 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株增殖能力的影響

在第1天時，A549和H1703細胞株中各組細胞OD值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。第2～5天，A549和H1703細胞株中shRNA-Napsin A組細胞OD值均低于shRNA-Control組和空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；shRNA-Control組和空白對照組細胞OD值比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；A549細胞株中shRNA-Napsin A組細胞OD值均低于H1703細胞株，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表1）

2.3 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株凋亡能力的影響

在第1天時，A549和H1703細胞株中各組細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。第2～5天，A549和H1703細胞株中shRNA-Napsin A組細胞凋亡率均高于shRNA-Control組和空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；shRNAControl組和空白對照組細胞凋亡率比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；A549細胞株中shRNANapsin A組細胞凋亡率均高于H1703細胞株，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表2）

2.4 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株侵襲能力的影響

在第1天時，A549和H1703細胞株中各組侵襲細胞數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。第2～5天，A549和H1703細胞株中shRNA-Napsin A組侵襲細胞數均少于shRNA-Control組和空白對照組，差異均有統計學意義（P＜0.05）；shRNAControl組和空白對照組侵襲細胞數比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）；A549細胞株中shRNANapsin A組侵襲細胞數均少于H1703細胞株，差異均有統計學意義（P＜0.05）。（表3）

表1 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株OD值的影響（±s）

表1 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株OD值的影響（±s）

組別A549細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組H1703細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組第1天923.6±45.4 934.3±44.2 930.6±45.2 937.2±44.6 935.9±45.4 938.3±46.1第2天2438.5±71.6 2838.2±105.4 2847.4±107.4 2625.6±88.6 2834.5±110.6 2842.7±108.5第3天3147.5±112.5 4729.2±157.6 4738.5±162.5 3702.5±134.6 4789.2±158.5 4728.3±160.2第4天4002.2±102.0 6948.3±168.4 6924.2±162.5 4638.2±128.5 6910.3±163.6 6943.9±164.8第5天5561.6±134.6 9934.3±155.6 9962.5±161.2 6235.2±142.1 9946.3±156.7 9976.7±160.3

表2 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株凋亡率的影響（%，±s）

表2 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株凋亡率的影響（%，±s）

組別A549細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組H1703細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組8.48±1.15 8.54±1.22 8.49±1.18 17.95±1.86 12.34±1.39 12.29±1.36 27.34±3.19 18.57±1.71 18.94±1.61 33.48±4.19 24.35±2.28 24.43±2.32 38.35±4.38 28.48±3.15 28.67±3.22 8.52±1.27 8.49±1.23 8.50±1.19 14.02±1.43 12.25±1.38 12.31±1.35 22.48±2.57 18.18±1.67 18.22±1.72 29.48±3.47 24.42±2.18 24.38±2.22 33.45±3.49 28.64±3.11 28.49±3.18第1天第2天第3天第4天第5天

表3 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株侵襲細胞數的影響（±s）

表3 靶向下調Napsin A基因對A549/H1703細胞株侵襲細胞數的影響（±s）

組別A549細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組H1703細胞shRNA-Napsin A組shRNA-Control組空白對照組10.49±1.67 10.38±1.72 10.77±1.48 13.48±1.89 18.51±2.15 18.52±2.31 16.49±2.08 24.30±2.37 24.24±2.43 19.35±2.27 39.41±2.36 29.34±2.38 22.19±2.56 32.85±2.87 32.95±2.94 10.52±1.54 10.49±1.63 10.55±1.71 15.45±2.04 18.18±2.16 18.49±2.22 20.16±2.49 24.26±2.49 24.39±2.55 25.48±2.78 29.18±2.45 29.48±2.43 28.54±3.01 32.91±2.94 33.08±3.01第1天第2天第3天第4天第5天

3 討論

在原發性肺癌中，區別小細胞肺癌和非小細胞肺癌一直是臨床工作者的重點，其對原發性肺癌的診療及預后評估具有重要價值，但對其亞級組織學類型（鱗狀細胞癌和腺癌）不夠重視[7-8]。隨著研究不斷深入，越來越多學者發現鑒別非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌對治療及預后亦十分重要[9]。近年，越來越多專家強調“精準治療”，分子靶向治療在腫瘤個體化治療中盛行，針對血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）新靶向藥物貝伐珠單抗在治療肺鱗狀細胞癌和腺癌中效果差異顯著，明確區分非小細胞肺癌組織學類型對患者意義重大[10-11]。但目前關于其鑒別診斷方法均為有創檢查，且均須術后才能確認，缺乏幫助患者于治療前完成鑒別診斷的方法，因此尋找一個區分非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌的特異性指標十分重要[12]。余何等[13]和孫廷誼等[14]發現Napsin A基因可幫助原發性肺癌分型診斷及肺鱗狀細胞癌和肺腺癌的鑒別診斷，但以上僅基于免疫組化結果，需要更多研究結果加以論證。

在本研究中，采用實時熒光定量PCR檢測分別從組織和細胞水平分析Napsin A基因在非小細胞肺腺癌/鱗狀細胞癌中的表達及差異，發現與癌旁正常組織比較，非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌組織中Napsin AmRNA均明顯升高（P＜0.01），提示Napsin A基因可能作為原癌基因參與非小細肺癌的發生發展；此外，還發現與鱗狀細胞癌比較，腺癌組織和細胞中Napsin AmRNA均明顯升高（P＜0.01），提示Napsin A基因對非小細胞肺腺癌作用可能強于鱗狀細胞癌，這與國內外主流觀點基本一致[15-16]。

為進一步探究Napsin A基因對非小細胞肺腺癌和鱗狀細胞癌的作用差異，本研究引入了重組慢病毒，并分別在A549（腺癌）和H1703（鱗狀細胞癌）中設定了shRNA-Napsin A組、shRNA-Control組和空白對照組，后分別采用CCK-8法、流式細胞儀和Transwell法分別檢測其增殖、凋亡及侵襲能力，發現A549和H1703細胞株中shRNA-Napsin A組細胞OD值和侵襲細胞數均低于shRNA-Control組和空白對照組（P＜0.05），細胞凋亡率均高于shRNA-Control組和空白對照組（P＜0.05），提示慢病毒構建成功，靶向下調能力顯著，Napsin A可促進非小細胞肺癌增殖和侵襲，抑制其凋亡，為Napsin A作為非小細胞肺癌的靶點提供了理論依據。此外，還發現在shRNA-Napsin A組中，A549細胞株OD值和侵襲細胞數均低于H1703細胞株（P＜0.05），細胞凋亡率高于H1703細胞株（P＜0.05），提示Napsin A基因對非小細胞肺腺癌增殖、侵襲能力的促進作用和凋亡能力的抑制作用明顯高于鱗狀細胞癌，提示Napsin A基因有望成為非小細肺腺癌和鱗狀細胞癌鑒別診斷和個體化治療的重要指標，但其具體作用機制有待后續繼續研究。

綜上所述，Napsin A基因在人非小細胞肺鱗狀細胞癌和肺腺癌中表達差異明顯，且靶向下調Napsin A基因抑制A549細胞增殖、侵襲能力，促進凋亡能力均優于H1703細胞，提示Napsin A基因有望成為非小細胞肺癌患者診斷、鑒別診斷及個體化治療的重要指標。