頸舒顆粒中有效成分含量測定

葉 慧，李 敏

（江蘇省泰州市食品藥品檢驗所，江蘇 泰州 225300）

頸舒顆粒是一種常用于治療頸椎病的6 類中成藥，由三七、川芎、當歸、肉桂、紅花、天麻、人工牛黃7 味中藥材組方。方中三七為君藥，化瘀、止痛、活血[1]；當歸[2]、紅花[3]、川芎[4]共為臣藥，補血行氣，活血祛瘀，以增強三七的活血化瘀止痛效力；肉桂[5]、天麻[6]為佐藥，肉桂溫陽通脈，天麻入肝經，善治風寒濕痹、眩暈麻木、肢體拘攣；人工牛黃為使藥，由牛膽粉、膽酸、豬去氧膽酸、牛磺酸、膽紅素、膽固醇、微量元素等加工制成[7]5，70，173，開竅通絡，藥性寒涼[8]，加入藥性辛溫的肉桂，既可平衡其寒涼，又能助其開竅通絡之功效，引領各藥直達病所。其功能活血化瘀、溫經、通竅、止痛，臨床主要用于神經根型頸椎病瘀血阻絡證，癥見頸肩部僵硬、疼痛，患側上肢竄痛等[7]1568－1569，對于氣滯血瘀證型頸椎病有較好效果[9－10]，配合針灸、手法、理療等能提高療效[11－12]。其現行質量標準收錄于2015 年版《中國藥典（一部）》，含量測定項下對三七藥材的人參皂苷Rg1和人參皂苷Rb1進行了定量測定，以及人工牛黃中的膽酸進行定量測定。在原標準基礎上，本研究中進一步補充了含量測定項的不足，建立了頸舒顆粒中有效成分含量測定的高效液相色譜（HPLC）法，為后續質量控制提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters Acquity Arc 型高效液相色譜儀（包括Empower?3 工作站，四元梯度泵，2998 PDA 檢測器，自動進樣器和柱溫箱），Waters?e2695 Separations Module 型高效液相色譜儀（包括Empower?3 工作站，四元梯度泵，2424 ELS 檢測器，自動進樣器和柱溫箱），均購自美國Waters 公司；8200 型超聲波清洗器（上海科導超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為53 kHz）；Milli－Q型超純水處理系統（美國Millipore 公司）；XS105DU 型電子天平（瑞士Mettler 公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

三七皂苷R1對照品（批號為110745 －201318，純度為94.0%），人參皂苷Rg1對照品（批號為110703 －201530，純度為91.7%），人參皂苷Re 對照品（批號為110754 －201626，純度為97.4% ），人參皂苷Rb1對照品（批號為110704 －201424，純度為93.7%），人參皂苷Rd 對照品（批號為111818，純度為92.1%），膽酸對照品（批號為100078 －201415，純度為98.9%），豬去氧膽酸對照品（批號為100087 －200610，純度為99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；頸舒顆粒（國藥集團精方＜安徽＞藥業股份有限公司，批號分別為171202，171209，180631）；三七、當歸、川芎、紅花、天麻、肉桂、人工牛黃藥材（市售，經泰州市食品藥品檢驗所仇雅靜主任中藥師鑒定為正品）；乙腈為色譜純（Fisher 公司）；甲醇為分析純（國藥集團化學試劑有限公司）；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 三七藥材中5 種成分含量測定

2.1.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters XBridge C18柱（250 mm ×4.6 mm，3.5 μm）；流動相：A 為乙腈溶液，B 為水溶液，梯度洗脫，0 ～20 min 時20%A，20 ～45 min 時20%A ～46%A，45 ～55 min 時46%A ～55%A，55 ～60 min 時55%A，60 ～62 min 時55%A ～20%A，62 ～70 min 時20%A；流速：0.8 mL／min；柱溫：30 ℃；檢測波長：203 nm；進樣量：10 μL。人參皂苷Rg1峰與人參皂苷Re 峰的分離度均大于1.5。

2.1.2 溶液制備

精密稱取三七皂苷R1對照品，人參皂苷Rg1，Re，Rb1，Rd 對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含三七皂苷R10.40 mg、人參皂苷Rg10.52 mg、人參皂苷Re 0.16 mg、人參皂苷Rb10.79 mg、人參皂苷Rd 0.72 mg 的混合對照品溶液。取樣品，研細，混勻，取2.0 g，精密稱定，置錐形瓶中，加入30 mL 乙醚，振搖提取2 h[2]，過濾，濾渣揮干，精密量取40 mL 甲醇，稱定質量，超聲處理（功率為250 W，33 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，過濾，蒸干，殘渣加20 mL 水溶解，用水飽和正丁醇溶液萃取3 次，每次25 mL，合并正丁醇液，用水飽和正丁醇溶液洗滌2 次，每次25 mL，正丁醇液蒸干，殘渣用甲醇溶解，轉移至10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過，即得供試品溶液。取缺三七藥材的其他藥材，按頸舒顆粒標準制法煎煮、濃縮為陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺三七藥材的陰性對照品溶液。

2.1.3 方法學考察[4]

專屬性試驗：按擬訂色譜條件分別對2.1.2 項下3種溶液進樣分析，記錄色譜圖，對照品溶液出峰順序為三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd。結果供試品溶液與對照品溶液色譜相應峰保留時間一致，陰性對照無干擾，且各組分相鄰成分之間分離度均較好（R ＞1.5）。色譜圖見圖1。

線性關系考察：取適量對照品，精密稱定，配成每1 mL含三七皂苷R10.74 mg、人參皂苷Rg12.62 mg、人參皂苷Re0.37mg、人參皂苷Rb12.75mg、人參皂苷Rd0.76mg的混合對照品溶液，稀釋2，3.33，5，10，20 倍[6]，分別進樣10μL，記錄峰面積，以對照品溶液質量濃度（X）為橫坐標、峰面積（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程。結果見表1。

精密度試驗：取2.1.1 項下對照品混合溶液，連續進樣6 次。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 色譜峰面積的RSD 分別為0.30%，0.47%，0.51%，0.40%，0.44%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為171202）適量，精密稱定，平行制備供試品溶液6 份，依法測定含量。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 的平均含量分別為1.46，2.95，0.38，1.92，1.45 mg ／g， RSD 分 別 為1.78% ，1.44% ，2.01% ，1.57%，1.67%（n ＝6），表明方法重復性良好。

圖1 三七高效液相色譜圖

表1 三七中5 種成分的線性關系考察結果

穩定性試驗：取樣品（批號為171202）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12，18，24 h時進樣測定，記錄峰面積。結果三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rd 峰面積的 RSD 分 別 為1.40% ，0.13% ，0.95% ，1.21% ，0.56%（n ＝7），表明供試品溶液在24 h 內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為171202），研細，稱取6 份，每份1.0 g，精密稱定，加入混合對照品溶液（質量濃度分別為三七皂苷R10.40 mg ／mL、人參皂苷Rg10.52 mg／mL、人參皂苷Re 0.16 mg ／mL、人參皂 苷Rb10.79 mg ／ mL、人 參 皂 苷Rd 0.71 mg ／ mL）2 mL，依法制備供試品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，即得。按擬訂色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，計算平均加樣回收率。結果見表2。

2.1.4 樣品含量測定[10]

取3 批樣品，對比2015 年版《中國藥典(一部)》與本研究中改進的提取方法制備供試品溶液，按外標法分別計算3 批樣品中5 種成分的含量。結果見表3。

2.2 人工牛黃中膽酸、豬去氧膽酸含量測定

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent Poroshell 120 EC －C18柱（150 mm ×4.6 mm，2.7 μm）；流動相：A 為乙腈溶液，B 為0.2%甲酸溶液，梯度洗脫，0 ～7 min 時5%A，7 ～20 min 時5%A ～80%A，20 ～25min 時80%A ～90%A，25 ～30min 時90%A ～96%A；流速：0.8 mL／min；柱溫：25 ℃；檢測器增益：10；氣體壓力：40 psi；噴霧器模式：加熱；功率級別：65%；漂移管溫度：60 ℃；進樣量：10 μL。

2.2.2 溶液制備

取膽酸、豬去氧膽酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含膽酸0.89 mg、豬去氧膽酸0.68 mg 的混合對照品溶液。取樣品適量，研細，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇10 mL，超聲處理（功率為250 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。取缺人工牛黃藥材的其他藥材，按頸舒顆粒標準制法煎煮、濃縮為陰性樣品，再按供試品溶液制備方法制備缺人工牛黃的陰性對照品溶液。

表2 加樣回收試驗結果（n ＝6）

表3 3 批樣品中皂苷類成分含量測定結果（mg ／g）

圖2 人工牛黃高效液相色譜圖

2.2.3 方法學考察

專屬性試驗：按擬訂色譜條件分別對2.2.2 項下3種溶液進樣分析，記錄色譜圖，對照品溶液出峰順序為膽酸、豬去氧膽酸。結果供試品溶液與對照品溶液色譜相應峰保留時間一致，陰性對照無干擾，且各組分相鄰成分之間分離度均大于1.5。色譜圖見圖2。

線性關系考察：取2.2.2 項下對照品溶液進行不同比例的稀釋，得系列線性對照品溶液，精密吸取各級對照品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，測得峰面積，以進樣量對數值（X）為橫坐標、峰面積對數值（Y）為縱坐標進行線性回歸，得回歸方程Y膽酸＝8.744 510 4 X膽酸－6.353 103，r ＝0.999 9；Y豬去氧膽酸＝7.101 810 4 X豬去氧膽酸＋6.619 103，r ＝0.999 4。膽酸和豬去氧膽酸進樣量對數值分別在1.94 ～19.45 μg 和1.00 ～9.97 μg 范圍內與峰面積對數值線性關系良好。

精密度試驗：取上述膽酸、豬去氧膽酸混合對照品溶液，連續進樣6 次，記錄色譜峰面積。結果的RSD 分別為1.90%和1.35%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為171202）適量，精密稱定，依法平行制備供試品溶液6 份，按擬訂色譜條件測定。結果膽酸和豬去氧膽酸平均含量分別為11.63 mg／g，7.67 mg／g，RSD 分別為0.29%和1.27%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為171202）適量，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，2，4，6，8，10，12 h時進樣，記錄峰面積。結果膽酸、豬去氧膽酸的RSD 分別為1.89%和1.92% （n ＝7），表明供試品溶液在12 h內穩定。

加樣回收試驗：取已知含量的樣品（批號為171202），研細，稱取6 份，每份0.25 g，精密稱定，加入（膽酸質量濃度為0.89 mg／mL、豬去氧膽酸質量濃度為0.68 mg／mL）混合對照品溶液2 mL，依法制備供試品溶液，定容至10 mL 容量瓶中，搖勻，按擬訂色譜條件進樣10 μL，測定峰面積，計算回收率。結果見表4。

表4 加樣回收試驗結果（n ＝6）

2.2.4 樣品含量測定

取3 批樣品，依法制備供試品溶液，采用HPLC －蒸發光散射檢測器(ELSD)法和HPLC－紫外可見分光光度(UV)法分別按改進方法和2015 年版《中國藥典(一部)》方法測定樣品中有效成分的含量。結果見表5。

表5 3 批樣品膽酸、豬去氧膽酸含量（mg ／g）

3 討論

3.1 三七藥材前處理考察

曾考察甲醇超聲、乙醚脫脂甲醇超聲、乙醚脫脂甲醇超聲再濃縮、乙醚脫脂甲醇超聲后正丁醇萃取4 種前處理方法。結果表明，經過乙醚洗滌、甲醇提取、正丁醇萃取、蒸干定容等步驟，溶劑峰減小，皂苷成分出峰明顯，分離度高，峰型較好，且雜質峰較少。

2015 年版《中國藥典(一部)》中三七含量測定項前處理（采用乙醚放置12 h，甲醇超聲提取），既浪費時間，又不能充分提取三七中皂苷類活性成分；改進后采用乙醚振搖提取，甲醇超聲提取、正丁醇萃取，既節約時間，又能提高活性成分的提取率。

3.2 人工牛黃藥材前處理考察

參考2015 年版《中國藥典（一部）》中頸舒顆粒含量測定項－人工牛黃，采用HPLC －UV 法，乙腈－0.2%磷酸水溶液（35 ∶65，V／ V），等度洗脫，色譜峰出峰快，且相應低；考慮到膽酸、豬去氧膽酸紫外吸收均為末端吸收，于紫外波長192 nm 檢測時，靈敏度低。采用HPLC－ELSD 法，以乙腈－0.2%甲酸溶液為流動相，梯度洗脫，基線穩定，檢測的靈敏度更高。