TNF-α 誘導的circMAN1A2 促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲和增殖

白麗麗,湯華

（天津醫科大學基礎醫學院病原生物學系，天津市生命科學中心實驗室，天津市炎癥生物學重點實驗室，天津300070）

宮頸癌（cervical cancer，CC）作為最常見的婦科癌癥，具有很高的發病率和死亡率，在全世界由癌癥導致的死亡病例中位于第四位［1］。每年全球大約有50 萬名女性被確診為宮頸癌，其中因為宮頸癌而死亡的人數更是遠遠超過了30 萬人［2］。科學證據清楚地表明，宮頸癌是由人乳頭瘤病毒（human papilloma virus，HPV）某些基因型的持續感染引起的［3］。因此，近年來細胞學和/或HPV 篩查計劃成為預防宮頸癌的有效措施［4］，外科手術結合放療和化療是治療和增加宮頸癌患者生存時間的主要策略［5］。然而，由于腫瘤的復發和轉移，宮頸癌患者的預后常常不如預期所料［6］。因此，深入研究宮頸癌發生的分子機制對開發新的癌癥相關生物標志物以及尋找新的治療方法都是至關重要的。

環狀RNA（circRNA）是一種非編碼RNA（noncoding RNA，ncRNA），也是近年來RNA 領域的研究熱點。CircRNA 不像線性RNA 那樣具有5′端帽結構和3′端多聚體（A）尾，而是形成了具有共價鍵的封閉環狀結構［7］。環狀RNA 不受RNA 核酸外切酶的影響，所以它的表達更穩定［8］。這些特性使得環狀RNA 在作為新的臨床診斷標志物的開發和應用中具有明顯的優勢。近來大量研究表明，circRNA 在許多生物過程中發揮重要作用［9］。在由特定蛋白質復合物和互補RNA 元件調節的反向剪接后，circRNA可通過與miRNA 或RNA 結合蛋白相互作用參與腫瘤進展［7，10-11］。越來越多的研究表明，circRNA 可以作為競爭性內源RNA（competing endogenous RNA，ceRNA）而發揮作用。例如：circRNA cTFRC 可以通過充當microRNA-107 的海綿，調節TFRC 的表達進而促進膀胱癌的進展［12］。

研究表明circMAN1A2 在鼻咽癌、口腔癌、甲狀腺癌、卵巢癌和肺癌中表達上調，可能作為這些疾病的血清學標志物，但其作用機制目前仍不明了［13］。在本研究中，通過RNA 高通量測序的方法發現TNF-α處理后HeLa 細胞中circMAN1A2 表達水平升高。過表達circMAN1A2 可以促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲和增殖能力。表明其在宮頸癌的診斷和治療中可能具有重要的潛在價值。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 宮頸癌HeLa 和SiHa 細胞（ATCC，美國），RPMI 1640 液體培養基，DMEM 液體培養基（GIBCO，美國），細胞培養箱（Thermo Fisher，美國），胎牛血清（FBS;GIBCO，美國），TNF-α（碧云天生物科技有限公司，中國），RNase R（廣州吉賽生物科技有限公司，中國），RNA 分離試劑盒（Active motif，美國），MTT（SIGMA-Aldrich，美國），LipofectamineTM 2000 regent（Invitrogen，美國）

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 人宮頸癌細胞系HeLa 和SiHa細胞在含有8%或10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素和100 IU/mL 青霉素的RPMI-1640 或DMEM 培養基中培養，將細胞孵育在37 ℃含5%CO2的培養箱中，待細胞匯合度達到80%～90%時進行傳代培養。

1.2.2 TNF-α 加藥處理 將HeLa 細胞接種至兩個100 mL 細胞培養瓶。40 h 后取出其中一瓶標記為“TNF-α 組”，棄去原培養液，加入8 mL 含60 ng/mL TNF-α 的培養液，另一瓶標記為“無處理組”，加入等體積的細胞培養液。

1.2.3 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 使用SYBR Premix Ex TaqTM（TaKaRa，中國）進行RT-qPCR 以檢測RNA 的表達水平。β-actin 作為內源性對照。RT-qPCR 的所有引物如表1 所示。

1.2.4 CircMAN1A2 過表達及敲降 質粒均由上海通用生物有限公司合成。

1.2.5 RNase R 耐受性 將HeLa 細胞接種到100 mL細胞培養瓶內，48 h 后提取宮頸癌細胞總RNA。用12 IU/μL RNaseR 處 理 后，通 過RT-qPCR 檢 測circMAN1A2 和lineMAN1A2 的表達水平。

表1 各基因引物序列Tab 1 Sequence of each gene primer

1.2.6 核質RNA 分離 按照Active motif 說明書步驟進行核質RNA 分離。

1.2.7 Transwell 遷移/侵襲 轉染24 h 后，1×PBS洗滌細胞，重懸于無血清培養基中并接種到不含/含Matrigel 的transwell 上層小室進行遷移（6×104細胞）/侵襲（8×104細胞）實驗。下室加入600 μL 含有20%FBS 的細胞培養基。溫育48 h 或72 h，將遷移/侵襲的細胞用固定液（75%甲醇-25%冰醋酸）固定并用結晶紫染色。在100 倍放大倍數下隨機選取5個視野，并在Nikon TE2000 顯微鏡下對遷移/侵襲的細胞計數。

1.2.8 MTT 轉染 24 h 后，以4000/孔的密度將細胞接種到96 孔板。分別在24 h、48 h 和72 h 加入10 μL MTT，繼續培養4～6 h。避光棄去原含MTT 的培養液，加入100 μL DMSO，避光搖晃5 min，使甲瓚充分溶解。測定OD490 波長處的吸光度值。

1.2.9 集落形成 轉染24 h 后，以500/孔的密度將細胞接種到12 孔板。每3 d 更換1 次新鮮培養液，持續兩周。用結晶紫染色，然后計算相對細胞集落形成率。

1.3 統計學處理 所有作圖軟件均為GraphPad Prism 6.0。兩組間均數比較采用t 檢驗方法進行處理。所有數據結果均代表3 次重復試驗的平均值。以P ＜0.05 作為有統計學意義的標準。

2 結果

2.1 TNF-α 促 進HeLa 細 胞 中circMAN1A2 表達 TNF-α 處理后的RNA 高通量測序分析共檢測到98 種表達上調和63 種表達下調的circRNA。其中表達上調的circMAN1A2 來源于MAN1A2 母基因，位于1 號染色體第117402186-117405645 堿基。經RT-qPCR 驗證得知circMAN1A2 表達水平確實升高（P＜0.001，圖1A）。RNase R 耐受性實驗結果表明相比于線性MAN1A2（lineMAN1A2），circMAN1A2更能夠耐受RNase R 消化（P＜0.05，P＜0.001，圖1B）。核質RNA 分離實驗表明circMAN1A2 主要定位于細胞核中（P＜0.001，圖1C）。

圖1 TNF-α 促進HeLa 細胞中circMAN1A2 表達Fig 1 TNF-α promotes the expression of circMAN1A2 in HeLa cells

2.2 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞遷移能力 為了研究circMAN1A2 對宮頸癌細胞惡性行為的影響，構建circMAN1A2 過表達及敲降質粒，并用RTqPCR 檢測質粒有效性。結果表明轉入circMAN1A2過表達質粒后circMAN1A2 表達水平升高，line-MAN1A2 表達水平沒有明顯變化；轉入circ-MAN1A2 敲降質粒后circMAN1A2 表達水平降低，lineMAN1A2 表達水平沒有明顯變化，表明構建的質粒只影響環狀RNA 表達水平而不影響線性RNA表達（P＜0.01，圖2A）。細胞遷移是指細胞在接收到遷移信號或感受到某種物質的梯度后而產生的移動。細胞遷移是正常細胞的功能之一，并且與癌癥轉移密切相關，因此利用transwell 遷移實驗來研究circMAN1A2 對腫瘤細胞遷移能力的影響。結果發現：過表達circMAN1A2 促進宮頸癌細胞遷移能力，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細胞遷移能力（P＜0.05，P＜0.001，圖2B；P＜0.01，P＜0.001，圖2C）。

圖2 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞遷移Fig 2 CircMAN1A2 promotes the migration of cervical cancer cell

2.3 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞侵襲能力 癌細胞侵襲是指腫瘤細胞向局部侵犯或遠處轉移的能力。癌細胞的侵襲轉移是惡性腫瘤最重要的特征之一，也是影響患者預后的主要因素。因此利用transwell 侵襲實驗來研究circMAN1A2 對腫瘤細胞侵襲能力的影響。結果發現：過表達circMAN1A2 促進宮頸癌細胞侵襲能力，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細胞侵襲能力（P＜0.01，圖3A；P＜0.01，P＜0.001，圖3B）。

圖3 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞侵襲Fig 3 CircMAN1A2 promotes the invasion of cervical cancer cell

2.4 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞活性 細胞活性是指細胞的生理狀態和功能。活細胞線粒體內的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT 還原為不溶性甲瓚并沉積在細胞中，而死細胞無此功能。因此利用MTT實驗來研究circMAN1A2 對腫瘤細胞活性的影響。過表達circMAN1A2 促進宮頸癌細胞活性，敲降circMAN1A2 抑制宮頸癌細胞活性（P＜0.01，P＜0.001，圖4A；P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001，圖4B）。

圖4 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞活性Fig 4 CircMAN1A2 promotes the viability of cervical cancer cell

2.5 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞體外增殖能力 單個細胞在體外持續增殖6 代以上，其后代形成一個細胞群體，稱為集落。因此集落形成實驗是檢測細胞增殖能力的有效方法之一。過表達circMAN1A2促進宮頸癌細胞體外增殖能力，敲降circMAN1A2抑制宮頸癌細胞體外增殖能力（P＜0.001，圖5A；P＜0.001，圖5B）。

圖5 CircMAN1A2 促進宮頸癌細胞體外增殖能力Fig 5 CircMAN1A2 promotes the proliferation of cervical cancer cells in vitro

3 討論

研究表明，宮頸癌是由HPV 某些基因型的持續感染引起的。而炎性細胞因子TNF-α 誘導的核因子-κB 活化是炎癥導致癌癥的常見機制。研究表明TNF-α 誘導的慢性炎癥能夠增加細胞的易感性并導致惡性腫瘤的進展［14-15］。在慢性炎癥轉化為癌癥的發生、發展過程中發現了很多miRNA，如miR-10a、miR-320a、miR-495 等與結腸癌或胃癌的進展有關［16-18］。筆者實驗室之前已經發現一些miRNA 受核因子-κB 轉錄調控，其中miR-23a 和miR-429 分別通過靶向核因子-κB 抑制蛋白激酶（IKK）α 和IKKβ 形成了反饋調節環［19-20］。但是，與慢性炎癥轉化為癌癥相關的circRNA 的研究卻幾乎沒有。因此，對這類circRNA 的研究將為宮頸癌的診斷和治療提供新的臨床依據。

近年來，大量研究表明，circRNA 與多種人類疾病的發生、發展密切相關，在幾種人類癌癥中充當必需的調節劑。已經發現許多circRNA 在宮頸癌中異常表達。例如，通過生物信息學分析發現，與正常組織相比，hsa_circRNA_101996 在宮頸癌組織中高表達，較高水平的hsa_circRNA_101996 與宮頸癌患者的預后不良有關，機制上，hsa_circRNA_101996通過miR-8075/TPX2 途徑抑制了宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲［21］。此外，hsa_circ_0000263 可通過影響miR-150-5p 調節MDM4 的表達促進腫瘤細胞增殖和遷移能力［22］。過表達的circ_0067934 可以通過miR-545/EIF3C 軸促進宮頸癌進展［23］。

本文研究結果表明，炎性細胞因子TNF-α 促進circMAN1A2 的表達，過表達circMAN1A2 促進宮頸癌細胞的遷移、侵襲和增殖。提示circMAN1A2 可能參與宮頸癌的發生、發展，并且可能為宮頸癌的診斷治療和預后提供新的思路。