ZIP4 與腫瘤生物學行為的研究進展

朱婷婷 綜述,周旋審校

（天津醫科大學腫瘤醫院頜面和耳鼻喉腫瘤科，國家腫瘤臨床醫學研究中心，天津市“腫瘤防治”重點實驗室，天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心，天津300060）

鋅是人體必需的微量元素之一，參與生物體內多種生理活動，例如調節酶的活性，參與體內電子傳遞，調控基因表達等［1］。最新研究表明，鋅對腫瘤的生長和轉移起重要作用，因為鋅是許多涉及血管生成、細胞增殖和癌細胞轉移的酶的重要組成部分，也是許多金屬酶的必要激活劑［2］。研究表明，缺鋅可引起生物體內細胞凋亡，但高濃度的鋅具有細胞毒性，因此機體進化出一套復雜的系統來維持鋅濃度的穩態。這一過程主要依賴于兩大基因家族編碼的蛋白來實現：SLC39 編碼的鋅鐵調控蛋白（ZRT，IRT-like protein，ZIP）蛋白家族和SLC30 編碼的鋅轉運體（Zn Transporter，ZnT）蛋白家族。兩者作用相反，ZIP 蛋白家族主要負責將鋅離子從細胞外或細胞器（或囊泡）轉運至細胞質中；而ZnT 蛋白家族則使鋅離子自細胞質轉運到循環血液或移入細胞器（或囊泡），兩者共同維持細胞內外鋅離子的穩態［3］，這對于維持機體正常生理活動起著至關重要作用。

在ZIP 家族的14 種跨膜蛋白中，僅發現ZIP4和ZIP5 在腸道上皮細胞中有表達。ZIP4 主要分布在十二指腸和空腸上皮細胞的頂端膜上，由8 個跨膜結構域組成，是鋅進入腸道上皮細胞最重要的轉運蛋白。ZIP4 在腸道上皮細胞中的表達和分布受腸道內鋅量調節，當腸道中鋅缺乏時，腸道上皮細胞中ZIP4 表達量明顯增加，并且主要集聚在腸道上皮細胞的頂端膜上；相反，當鋅攝入增多時，腸道上皮細胞中ZIP4 表達量減少，腸道上皮細胞頂端膜上ZIP4 表達量急劇下降，此時ZIP4 主要位于細胞質核周囊泡中［4］。有研究表明敲低ZIP4，會降低細胞內鋅含量，導致與DNA 合成有關的脫氧胸苷激酶活性降低，細胞生長遲緩，免疫反應受損，傷口愈合變慢并阻礙骨骼發育［2，5］。

好歹他們勤勞的本色不變：楊秋香該忙家務活兒還忙家務活兒，有時她也到超市幫忙干點雜活兒。楊力生該接待往來客戶，還是熱心地接待往來客戶，夫妻二人各盡其責，但就是誰也不肯先理睬誰。

1 ZIP4 表達紊亂與腫瘤關系密切

大量研究表明ZIP4 的異常表達與腫瘤的發生和轉移有著密切關系［6-8］。Oncomine 數據庫（http://www.oncomine.org）分析了多種惡性腫瘤中ZIP4 的表達，在淋巴瘤、膠質瘤、惡性黑色素瘤、胰腺癌、口腔鱗癌、卵巢癌、轉移性結腸癌等多種惡性腫瘤中ZIP4 表達升高，且與腫瘤的惡性程度、臨床分期相關［9-11］。但在前列腺癌中ZIP4 的表達量較正常組織明顯減少，表現為抑癌基因的功能［12］。這些結果表明ZIP4 表達紊亂是惡性腫瘤的特異性分子標簽之一。

分別對臨床有效率和PCO2繪制倒漏斗圖，見圖8、9。結果顯示納入研究數據點基本分布在對稱軸的兩側，且位于倒漏斗圖的頂部，但臨床有效率的個別數據點在倒漏斗圖中下部、PCO2的個別數據點在倒漏斗圖線邊緣，提示可能存在發表偏移。

2 ZIP4 與腫瘤細胞周期

4.1.4 ZIP4 促進ECM 的降解 基質金屬蛋白酶（Matrix metallopoteinases，MMPs）是一組能夠降解ECM 的鋅離子依賴型內肽酶。ECM 和基底膜的降解是腫瘤侵襲和轉移的關鍵環節。Zhang 等［36］研究胰腺癌時發現ZIP4 過表達的異種移植瘤中，兩種主要的MMP（MMP-2 和MMP-9）的表達比載體對照異種移植瘤組明顯增加，MMP 是在癌細胞侵襲和轉移中發揮關鍵作用的酶，表明ZIP4 可能通過MMP 途徑促進胰腺癌細胞生長和侵襲。Xu 等［27］在肝癌的研究中也發現ZIP4 的過表達導致MMP-2 和MMP-9 的表達明顯增加。因此，ZIP4 可以通過促進ECM 的降解促進EMT 發生。

3 ZIP4 與腫瘤細胞凋亡

4.1.2 抑制腫瘤細胞的轉移能力 Zhang 等［32］在研究胰腺癌時發現，ZIP4/CREB 促進miR-373 轉錄并以“單擊多靶”的方式調節TP53INP1、LATS2 和CD44 等基因表達。TP53INP1 是促凋亡應激誘導的p53 靶基因，其表達增加可以抑制腫瘤細胞生長［33］。LATS2 是一種絲氨酸-蘇氨酸激酶，是在p53 介導的CDK 通路中起重要作用的腫瘤生長抑制劑［34］。CD44 是透明質酸的細胞表面受體，并且是乳腺癌、前列腺癌和結腸癌中的已知腫瘤轉移抑制因子［35］。因此，ZIP4 可以通過下調TP53INP1、LATS2 和CD44影響胰腺癌細胞增殖、侵襲和轉移能力，表明ZIP4-CREB-miR-373 信號轉導通路可能參與促進胰腺癌細胞生長。

4 ZIP4 對腫瘤細胞侵襲轉移的影響

4.1 ZIP4 促進腫瘤細胞發生EMT EMT 是促進腫瘤細胞侵襲、轉移的一個關鍵因素。EMT 的特征是細胞失去連接和細胞極性改變，同時細胞獲得間質表型和侵襲能力。E-鈣黏蛋白（cadherin）表達的缺失是發生EMT 的主要誘因。一些研究表明ZIP4 可以通過解除細胞間連接結構，促進細胞肌動蛋白骨架重排，促進細胞外基質的降解等方式，促進EMT的發生，進而促進腫瘤細胞的侵襲、轉移。

ZIP4 在腫瘤侵襲轉移中起著重要作用。多項研究表明ZIP4 在腫瘤組織中的表達高于非腫瘤組織，ZIP4 表達與腫瘤遷移、侵襲、復發、Child-Turcotte-Pugh 評分、總生存期和無瘤生存期顯著相關［27］。ZIP4促進腫瘤侵襲轉移主要通過以下幾種方式：促進腫瘤細胞發生上皮-間充質轉化（EMT），主要包括解除細胞間連接結構，促進細胞肌動蛋白骨架重排，降解細胞外基質等；促進炎癥介質的產生，增加血管通透性進而促進腫瘤細胞滲入血管及淋巴管；促進血管新生。

4.1.1 解除細胞間連接結構 ZO-1 和claudin-1 是防止癌細胞遷移的重要的細胞間連接蛋白。Liu 等［28］的最新研究表明，ZIP4 在胰腺癌細胞中以ZEB1 依賴的方式抑制ZO-1 和claudin-1 的表達，進而導致FAK 和Paxillin 的磷酸化，促進腫瘤的遷移和侵襲，而且ZIP4 抑制ZO-1 和claudin-1 的表達是獨立于CREB 的調控。ZEB1 是鋅依賴的轉錄因子，主要通過TGF-β、BMP、NF-κB 和Notch 等信號通路參與腫瘤細胞遷移和侵襲［29-30］。因此，在胰腺癌中阻斷ZIP4-ZEB1-ZO-1-claudin-1-FAK-Paxillin 信號通路或許能為胰腺癌的治療提供新的思路。Wu 等［31］在研究中發現敲低ZIP4 后可以誘導更多上皮樣表型的表達，如E-鈣黏蛋白表達升高，而一些間質表型指標如FSP-1 和N-鈣黏蛋白表達降低，進而抑制EMT 的發生。

“長安城里的那些老爺太太，公子小姐，秀才軍漢，吃飽了飯，就愛信這一套，天子腳下錦衣玉食的日子不愛，每年都帶著大包小包的銀子來照顧我們的生意，哈哈哈！你們幾個瓦匠，靠泥刀苦哈哈掙錢，秀才靠青燈黃卷背書騙錢，你個捕快靠橫刀刀頭舔血賺錢，我老黃帶著兄弟們蒙著臉掄錘子大刀搶錢，都不如鳥窩瞎子編故事騙錢來得快！”

多項研究表明減少腫瘤細胞中ZIP4 的表達可以通過不同信號通路來誘導腫瘤細胞凋亡和抑制腫瘤細胞生長［18］。生物體內細胞經典的凋亡方式是Bcl-2和caspase 通路，最常見的細胞凋亡方式是通過caspase 介導的［19-20］。Caspase-9 是內源性凋亡通路的上游啟動子，可誘導下游caspase 信號通路級聯放大［21］。Cui 等［22］研究發現，在低鋅環境中，caspase-9/caspase-7/PARP 級聯反應可以誘導細胞凋亡，而ZIP4 過表達可以抑制caspase-9 和caspase-7 裂解并阻斷凋亡信號轉導，進一步抑制PARP 的切割，從而減少細胞凋亡。細胞色素C 是caspase-9 的激活劑，Bax 和Bak 可以通過線粒體和內質網途徑促進細胞凋亡［23］。ZIP4 過表達時細胞色素C 和Bax 下調，而ZIP4 沉默時細胞色素C 和Bax 表達升高，而Bak 表達沒有差異，所以，ZIP4 很可能是通過細胞色素C和Bax 途徑產生對凋亡的抗性。除了由caspase-9誘發的內在信號轉導途徑外，凋亡信號轉導中的其他關鍵參與者，例如由caspase-8 啟動的TNF 途徑［24］和由凋亡誘導因子（AIF）介導的半胱天冬酶非依賴途徑［25］，可能也參與ZIP4 介導的細胞凋亡的抗性。在頭頸部鱗癌的一項研究中，證實激活的EGFR 可以通過IL-6/JAK/STAT3 信號通路上調PD-L1 的表達。用表皮生長因子受體-酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKIs）處理細胞可以下調IL-6/JAK/STAT3途徑的活化，進而減少PD-L1 的表達，從而促進腫瘤細胞的凋亡［26］。Xu 等［27］研究表明ZIP4 可以抑制凋亡相關蛋白caspase-3、caspase-9、BAX 的表達，增加抗凋亡蛋白Bcl-2 的表達，抑制肝癌細胞凋亡并促進肝癌的進展。因此，降低腫瘤細胞中ZIP4 的表達可以誘導腫瘤細胞凋亡。

4.2 促進炎性介質的產生 在腫瘤侵襲模型中，腫瘤細胞產生的炎性介質IL-1、TNF-α 及IL-6 主要是通過NF-κB 和STAT3 途徑促進MMPs 表達，影響癌細胞的侵襲性和轉移能力。Zhang 等［15］研究表明ZIP4 過表達引起CREB 磷酸化，IL-6 分泌增加，進而激活STAT3 并導致cyclin D1 表達增加，導致胰腺癌中細胞增殖和腫瘤進展。Li 等［38］研究表明在胰腺癌細胞中敲低ZIP4 的表達時，NF-κB 的活性明顯降低，表明NF-κB 也可能參與ZIP4 沉默誘導的胰腺癌細胞生長抑制。NF-κB 是腫瘤相關炎癥的重要調節因子之一，可以誘導轉錄因子snail 和Twist轉錄，進而促進腫瘤細胞的EMT［39］。

4.1.5 ZIP4 促進腫瘤細胞獲得抗衰老、抗凋亡抗性 Fan等［37］在卵巢癌研究中表明敲低ZIP4 會降低卵巢癌細胞的失巢凋亡抗性和集落形成活性、球體形成活性和耐藥性等腫瘤干細胞相關活性。說明ZIP4 可以通過增加腫瘤干細胞相關活性促進EMT 發生。

來自多個不同研究小組的研究表明，敲低ZIP4可以通過阻滯G1/S 期的細胞周期進程來抑制腫瘤細胞增殖［11-14］。Ishida 等［11］進行細胞周期分析時發現，敲低ZIP4 后，G1期細胞數明顯多于對照組，證明敲低ZIP4 可以使細胞周期被阻滯在G1期從而抑制細胞增殖。同時發現，敲低ZIP4 后，CDKIs 表達升高，細胞周期蛋白D1（cyclinD1）、細胞周期蛋白E（cyclinE）、細胞周期蛋白依賴性激酶（CDK2）、CDK4 和CDK6表達減少。有研究顯示，ZIP4 在胰腺癌中通過激活白細胞介素（IL）-6/信號轉導與轉錄激活因子（STAT）3 信號通路來調控腫瘤細胞的生長，其通過CREB引起IL-6 表達增加，IL-6 又激活STAT3 并導致cyclin D1 表達增加，進而導致胰腺癌細胞增殖和腫瘤進展。Cyclin D1 是G1/S 期轉化的關鍵細胞周期調控蛋白［15］，cyclin D1與CDK（CDK4 或CDK6）的結合導致成視網膜細胞瘤蛋白（Rb）的磷酸化，E2F 被釋放、活化，解除了S 期所需要基因的轉錄阻斷，細胞由G1期向S 期轉化［16］。E2F1 的轉錄靶點包括細胞周期蛋白（如CDC2、CDC25A、cyclin D1 和cyclin E）與DNA 復制和（或）DNA 修復所需的蛋白（如DHFR、DNA 聚合酶α，RCF3 和Rad52E），這些蛋白都是細胞周期G1/S 期轉換至關重要的蛋白［17］。因此，敲低ZIP4 時，cyclin D1 表達會減少，繼而影響E2F1的表達，從而導致細胞周期阻滯。

其次，構造各單層次判斷矩陣，采用問卷調查的方式收集判斷矩陣的數據。調查對象包括在制造業升級研究領域較為權威的專家、學者和山東省相關產業政策研究部門的工作人員。通過綜合考慮相關調查人員的打分情況，構造出層次判斷矩陣，對應表1，各個層次判斷矩陣分別用A、A1、A2和A3來表示。

4.1.3 促進肌動蛋白骨架重排 Liu 等［28］發現ZIP4可導致FAK 和paxillin 的磷酸化。FAK 在整合素和RTK 介導的信號轉導中起核心作用，并在細胞骨架變化、板狀偽足形成和細胞增殖和運動中起關鍵作用。Paxillin 是細胞外基質（ECM）和肌動蛋白細胞骨架之間聯系的橋梁［14］，酪氨酸磷酸化對于paxillin 促進腫瘤細胞的侵襲性是必需的。因此，ZIP4 可以通過促進FAK 和paxillin 的磷酸化進而促進肌動蛋白骨架重排，促進EMT 的發生。本課題組通過比較用不同濃度鋅離子處理和過表達ZIP4 的Detroit562細胞和Fadu 細胞中細胞骨架F-actin 形態學改變，發現高濃度鋅離子處理組中腫瘤細胞侵襲性偽足數量明顯增加，F-actin 由原來卷曲型纖維轉變為應力型纖維，這提示ZIP4 過表達可以促進HNSCC 細胞骨架重塑，增加細胞的侵襲能力。

4.3 ZIP4 促進血管新生 神經纖毛蛋白（NRPS）是Ⅰ型跨膜糖蛋白，一些研究表明，NRPS 在腫瘤生長和血管生成中起重要作用，并有可能作為預測前列腺癌、乳腺癌和胰腺癌的進展的生物標志物。Zhang等［36］發現ZIP4 過表達的胰腺癌異種移植瘤中神經纖毛蛋白-1（NRP-1）、血管內皮生長因子（VEGF）表達升高，這表明ZIP4 介導的胰腺癌細胞生長可能與其促血管新生有關。

5 ZIP4 與腫瘤細胞化療耐藥

Li 等［38］研究發現在胰腺癌細胞中敲低ZIP4 的表達時，NF-κB 的活性明顯降低，cyclin D1 表達也明顯降低，繼而導致化療藥物（如順鉑和氟嘧啶）的腫瘤生長抑制作用增強。研究表明NF-κB 信號通路與胰腺癌產生化療耐藥性密切相關，其可以通過誘導抗凋亡bcl2 蛋白的表達來促進癌細胞產生化療耐藥［17，20］。因此，在cyclin D1 過表達細胞中觀察到NF-κB 活化增加可能反過來上調抗細胞凋亡蛋白的表達，最終保護細胞免于凋亡。Biliran 等［40］研究發現，在Ela-myc 胰腺腫瘤細胞系中過表達ZIP4 會上調cyclin D1，使得腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性，相反，敲低ZIP4 后，cyclin D1 表達減少會導致對順鉑誘導的凋亡的敏感性增加。這些研究表明ZIP4 影響cyclin D1 的表達后，參與了胰腺癌化療耐藥，這也是胰腺癌中ZIP4 升高可能會產生不良預后的原因之一。Wu 等［31］研究也證明了ZIP4 增強了非小細胞肺癌細胞對順鉑治療的抗性。因此，ZIP4 可以作為腫瘤化療耐藥的重要預測分子和逆轉腫瘤化療耐藥的候選靶點。

第三，被信任和認可的優勢。被信任和認可，不僅體現在養老服務的專業化方面，還體現在個人信息安全是否得到保障等方面。基于區塊鏈技術的智慧養老服務模式的構建，所有的養老服務數據都是被加密的，用密碼學的方式方法保證了數據的獲取權限，以及數據的完整性、連續性和一致性，智慧養老服務平臺的安全性得到了保障。同時，智慧養老平臺會對服務對象的全部生物信息數據進行清晰地記錄，確保平臺數據的及時性。平臺數據的安全性和及時性，樹立了智慧養老服務模式的專業性，整體上提升了服務受益群體對智慧養老服務模式的信任和認可度。

6 ZIP4 與腫瘤患者預后相關

Xu 等［27］研究表明ZIP4 與腫瘤復發、腫瘤大小、TNM 分期和CTP 評分相關。ZIP4 表達高的患者具有更高的復發率和更短的生存時間。因此，ZIP4 高表達可以作為肝癌后肝移植總體存活率的獨立且有效的預后因素，可以作為一個新的治療靶點和肝癌后肝移植合適的預后標志物。Lin 等［9］研究表明與ZIP4 表達水平顯著相關的基因主要是轉錄因子如鋅指蛋白、DNA 或RNA 結合蛋白，它們高度參與細胞侵襲和血管生成，并且與患者的生存率呈負相關。ZIP4 表達與膠質瘤患者的腫瘤分級和臨床結果顯著相關，可能成為膠質瘤患者有希望的生物標志物。

綜上所述，ZIP4 在多種腫瘤細胞的增殖、細胞周期演進與侵襲轉移等方面都發揮著重要作用，這使得ZIP4 可能具有成為預測腫瘤進展、復發與轉移的重要分子標志物的潛能。因此需要進一步研究ZIP4與腫瘤發生、發展的關系以開發新型腫瘤治療方法。