巴戟天提取物聯合GABA/茶氨酸改善小鼠睡眠作用的研究

周月,劉歡

（天津醫科大學公共衛生學院營養與食品衛生學系，天津300070）

我國茶葉資源豐富，但利用率較低，每年有大量中低檔、春秋茶被廢棄，而茶葉中含有的多種功能成分有較高的利用價值，其中γ-氨基丁酸（gamma-amino butyric acid，GABA）和L-茶氨酸（L-Theanine）對于睡眠有一定的改善作用。GABA是一個四碳非蛋白氨基酸，廣泛存在于動物、植物和微生物中，具有提神安寧以及提高睡眠質量和記憶力的作用［1］。GABA 在食品及醫藥等方面已得到廣泛應用，毒性評估支持其安全使用和作為功能性食品成分的潛在用途［2］。茶氨酸是茶葉中重要的非必需酰胺類生物活性氨基酸之一，在茶樹新鮮重量中的平均含量在1.2～6.2 mg/g［3］，具有維持正常睡眠、改善記憶功能、消除神經毒素的作用，在緩解壓力、緩解疲勞方面也具有一定的作用［4-5］，而作用可能會有助于身心疲勞的恢復從而改善睡眠。有研究發現GABA 和L-茶氨酸混合物對睡眠質量和持續時間具有積極的協同作用［6］。中藥巴戟天（Morinda officinalis）為茜草科多年生藤植物，具有抗疲勞的作用［7］，其改善睡眠的文獻報道較少。本實驗旨在觀察GABA/茶氨酸聯合干預以及添加巴戟天提取物后對小鼠睡眠的影響，探討中藥聯合茶葉中活性成分對睡眠的改善作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗對象 健康ICR 種小鼠，單一雄性，SPF級，體質量18～20 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，實驗動物生產許可證號：SCXK（京）2016-0006 號。實驗動物飼養于中國醫學科學院放射醫學研究所動物實驗中心。基礎飼料由北京阜康生物科技股份有限公司提供。

1.1.2 藥品與試劑 GABA/茶氨酸、巴戟天/GABA/茶氨酸混合物均為粉末狀（實驗前用蒸餾水溶解配置），其中GABA、茶氨酸符合新食品原料要求，GABA 純度95%，茶氨酸純度是20%；巴戟天提取物采用水提工藝，購自廣東青云山藥業有限公司；戊巴比妥鈉，進口分裝，Sigma-Aldrich 提供；巴比妥鈉，分析純，成都西亞化工股份有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗分組 240 只小鼠按體質量分層后，隨機分為5 個干預組，即對照組、GABA/茶氨酸低劑量組、GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組。對照組給予蒸餾水；GABA/茶氨酸低劑量組（GABA15 mg+茶氨酸33 mg）/（kg·d）；GABA/茶氨酸高劑量組（GABA45mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d）；巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組（巴戟天提取物250mg+GABA15mg+茶氨酸33 mg）/（kg·d），巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組（巴戟天提取物250 mg+GABA45 mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d）。均為灌胃干預，干預時間30 d。

各干預組中的小鼠再隨機分為4 組，分別進行直接睡眠實驗，延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗和巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗，每組12 只。

1.2.2 直接睡眠實驗 適應性飼養1 周后，各組小鼠連續灌胃30 d，最后一天結束直接觀察小鼠睡眠情況。以翻正反射消失為睡眠（提起小鼠尾巴，將小鼠腹部朝上放置，超過60 s 不能翻正者即認為翻正反射消失，進入睡眠），以翻正反射恢復為覺醒，翻正反射消失至恢復這段時間為小鼠睡眠時間，記錄入睡小鼠只數及睡眠時間。

1.2.3 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗 末次灌胃15 min 后腹腔注射戊巴比妥鈉40 mg/kg·bw（此劑量為預實驗確定的使小鼠100%入睡，但又不使睡眠時間過長的戊巴比妥鈉劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失為指標，記錄戊巴比妥鈉睡眠時間。

1.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗 末次灌胃15 min 后腹腔注射戊巴比妥鈉28 mg/kg（此劑量為預實驗確定的戊巴比妥鈉閾下催眠劑量，即80%～90%小鼠翻正反射不消失的戊巴比妥鈉最大閾下劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失1 min 以上為入睡標準，記錄30 min 內各組入睡的小鼠只數。

1.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗 末次灌胃20 min后腹腔注射巴比妥鈉260 mg/kg(此劑量為預實驗確定的使動物100%入睡，但又不使睡眠時間過長的巴比妥鈉劑量），注射量為0.2 ml/20 g，以翻正反射消失為指標，腹腔注射完成到翻正反射消失的這段時間為睡眠潛伏期，記錄各組小鼠睡眠潛伏期。

1.3 結果判定 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗、戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗、巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗3 項實驗中兩項陽性，且無明顯直接睡眠作用，可判定具有改善睡眠功能作用。

1.4 統計學方法 采用SPSS18.0 對實驗數據進行單因素方差分析或卡方檢驗。睡眠時間及其睡眠潛伏時間采用單因素方差分析進行統計分析。入睡只數采用卡方檢驗進行統計分析，比較各組睡眠發生率是否相等。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 直接睡眠實驗結果 GABA/茶氨酸劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸劑量組灌胃后均未直接出現睡眠現象，表明本實驗相應的實驗條件下兩種混合物均無直接睡眠作用，見表1。

表1 各干預物對小鼠直接睡眠的影響Tab 1 Effects of tested drugs on sleep-induced directly in mice

2.2 延長戊巴比妥鈉睡眠時間實驗結果 經單因素方差分析，GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸兩個劑量組的睡眠時間與對照組的睡眠時間比較顯著延長，差異均有統計學意義（均P＜0.05），同時巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組睡眠時間比其低劑量組延長（P＜0.05），也明顯長于GABA/茶氨酸高劑量組（P＜0.05）。GABA/茶氨酸低劑量組的睡眠時間與對照組相比差異無統計學意義（P＞0.05）。說明兩種混合物均能延長戊巴比妥鈉誘導的小鼠睡眠時間，但巴戟天/GABA/茶氨酸的聯合作用優于GABA/茶氨酸，見表2。

表2 各干預物對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響(±s)Tab 2 Effects of tested drugs on pentobarbital sodium -induced sleep in mice(±s)

表2 各干預物對戊巴比妥鈉睡眠時間的影響(±s)Tab 2 Effects of tested drugs on pentobarbital sodium -induced sleep in mice(±s)

注：與對照組比較：*P＜0.05；與巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組比較：#P＜0.05

組別 動物數/只入睡動物數/只 睡眠時間/min對照組 12 12 87.08±9.56 GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 99.42±13.65 GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 117.10±30.52*#巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 123.25±25.91*巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 161.50±17.76*

2.3 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實驗結果 經過多個樣本率的卡方檢驗，各組與對照組之間比較睡眠發生率增加，但差異無統計學意義（P＞0.05），尚不能認為各干預物可提高閾下劑量戊巴比妥鈉誘導的小鼠的睡眠率，見表3。

2.4 巴比妥鈉睡眠潛伏期實驗結果 經單因素方差分析，GABA/茶氨酸高劑量組、巴戟天/GABA/茶氨酸兩個劑量組與正常對照組之間的睡眠潛伏時間比較顯著縮短，差異均有統計學意義（均P＜0.05）。巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組的睡眠潛伏時間比其低劑量組縮短（P＜0.05），表現出一定的劑量反應關系，同時該組睡眠潛伏時間也短于GABA/茶氨酸高劑量（P＜0.05），說明巴戟天/GABA/茶氨酸縮短巴比妥鈉誘導的ICR 小鼠睡眠潛伏期的作用優于GABA/茶氨酸，見表4。

表4 各干預物對戊巴比妥鈉睡眠潛伏期的影響(±s)Tab 4 Effects of tested drugs on sodium barbital -induced sleep in mice(±s)

注：與對照組比較：*P＜0.05；與巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組比較：#P＜0.05

組別 動物數/只入睡動物數/只 睡眠潛伏期/min對照組 12 12 36.42±4.71 GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 35.54±5.96 GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 29.51±5.19*#巴戟天/GABA/茶氨酸低劑量組 12 12 29.58±5.52*#巴戟天/GABA/茶氨酸高劑量組 12 12 22.67±3.55**

3 討論

失眠是指持續的睡眠質或量令人不滿意的狀態，嚴重者甚至影響白天社會功能［8］。正常的睡眠除了可以消除疲勞，使人產生新的活力外，還與提高免疫力、抵抗疾病的能力有著密切的關系［9］。隨著經濟的快速發展，人們的生活及其精神壓力增大，失眠現象日趨增多，嚴重影響著人們的精神狀態甚至身體健康從而降低生活質量、學習或工作效率。

GABA 和茶氨酸均為茶葉中的功能性成分，已有研究發現GABA 和茶氨酸聯合對睡眠的積極作用。巴戟天作為具有抗抑郁作用的中藥，已被批準可用于保健食品。觀察三者聯合干預對小鼠睡眠的影響，可為探討中藥聯合食品功能性成分的保健作用提供科學依據。

目前筆者檢索到的GABA 改善小鼠睡眠作用的最低作用劑量為100 mg/kg［10］；茶氨酸改善小鼠睡眠作用的最低作用劑量為100 mg/kg［11］。本研究中GABA/茶氨酸的干預劑量均低于100 mg/kg，其中高劑量組灌胃劑量為（GABA45 mg+茶氨酸100 mg）/（kg·d），而根據原材料純度換算GABA 和茶氨酸實際含量為（42.75 mg 和20 mg/kg）/（kg·d），此干預劑量即可延長小鼠睡眠時間并縮短睡眠潛伏期，說明兩者具有聯合改善小鼠睡眠的作用。而如果干預制劑中添加巴戟天提取物，GABA 和茶氨酸在實際含量分別為14.25 mg/kg 和6.7 mg/kg下，即表現出改善睡眠的作用。巴戟天/GABA/茶氨酸三者聯合也具有劑量反應關系，隨著劑量增高，改善睡眠的作用也更加明顯。在GABA/茶氨酸劑量相同的條件下，巴戟天提取物的添加表現出了協同增效作用。

GABA 是中樞神經系統中很重要的抑制性神經遞質，直接參與睡眠-覺醒過程的調節［12］。可以抑制ICR 小鼠的活動，減少能量的消耗，促進睡眠。GABA作用的減弱會導致乙酰膽堿釋放增加，促進快速眼動睡眠［13］。某些研究中可以影響5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）和多巴胺（dopamine，DA）的濃度［14］。GABA 特征的重復超低頻磁場的連續多次經顱刺激可以興奮正常大鼠腦內的GABA、5-HT 與DA［15］。茶氨酸經腸道吸收以后，可以越過血腦屏障，增加腦內GABA、5-HT 和DA 的濃度［16］。在抗抑郁研究中巴戟天提取物可提高抑郁患者體內5-HT、DA含量［17］。5-HT 和DA 是參與機體睡眠-覺醒過程重要的中樞神經遞質，其中5-HT 調節睡眠-覺醒周期，延長非快速眼動睡眠，從而抑制覺醒，增加深度睡眠并縮短入眠期和淺睡期。DA 具有維持覺醒和行為興奮的作用，正常含量下可減少覺醒次數，保證睡眠的完整度［18］。因此推測GABA、茶氨酸和巴戟天提取物改善睡眠的作用與改變體內單胺類神經遞質有關，其具體機制尚需進一步探討。