去腎交感神經(jīng)術對大鼠下丘腦血管緊張素II 及其受體的影響

安玉楠,馬藝杰,王麗,2,李竹青,盧成志,2

（1 天津醫(yī)科大學研究生院，天津300070；2 天津市第一中心醫(yī)院心內科，天津300192）

高血壓作為一種慢性疾病影響著全世界大約40%的成年人口［1］，而在接受治療患者中，血壓的有效控制率僅為37.5%，是導致心力衰竭、卒中、慢性腎病甚至死亡的主要原因，作為心血管事件和死亡的可改變風險因素，控制高血壓可以改善心血管結局。抗高血壓藥物如利尿劑、β 受體阻滯劑、鈣通道阻滯劑（calcium channel blocker，CCB）、血管緊張素轉換酶抑制劑（angiotensinconvertingenzymeinhibitor，ACEI）和血管緊張素II 受體阻滯劑（angiotensin II receptor blocker，ARB）等在臨床治療中取得了不錯的療效，但是還有一部分患者血壓得不到理想的控制，針對這個現(xiàn)象，器械治療如：射頻消融導管系統(tǒng)、頸動脈竇壓力感受器器械治療、中央動靜脈吻合術、頸動脈體消融等應運而生。其中射頻消融導管系統(tǒng)中的去腎交感神經(jīng)術（renal sympathetic denervation，RDN）是被臨床應用最廣泛的一種非藥物治療高血壓的方式。特別是近年來Symplicity Spyral HTN-OFF 和Symplicity Spyral HTN-ON 研究結果的發(fā)布，證實了RDN 可顯著降低患者血壓［2-4］。本研究組已有研究成果表明RDN 可以通過降低腎交感神經(jīng)活性降低腎素-血管緊張素-醛固酮（renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS）活性，從而降低患者血壓，然而RDN 對于中樞系統(tǒng)調控血壓的作用機制不夠明確。因此，本研究希望通過觀察RDN對于高血壓大鼠的血壓及相關指標變化，進一步了解RDN 對于大鼠中樞系統(tǒng)的影響；對于特異性神經(jīng)損傷因子的監(jiān)測，尋找RDN 治療有效性的判斷指標。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康雄性12 周齡，體質量250～290 g（北京維通利華實驗動物有限公司提供）的自發(fā)性高血壓大鼠（SHR 大鼠）36 只、Wistar-Kyoto 大鼠（WKY 大鼠）12 只。采用隨機數(shù)字表法將36 只SHR 大鼠分為對照組（DC 組，n=12）、手術組（術后1 周為DO1組，n=6；術后6 周為DO6，n=6）、假手術組（術后1 周為DS1組，n=6；術后6 周為DS6，n=6）。WKY 大鼠為正常對照組（NC 組，n=12）。保持濕度在40%～70%，控制溫度22～24℃。所有大鼠手術或假手術前禁食8 h。處死動物后分別采血，取腎臟及下丘腦組織待檢測。所有動物手術操作方法均遵守動物倫理委員會規(guī)程。

1.2 RDN 及假手術 用5%的水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，后鋪巾消毒。分離出腎臟動靜脈，在×25 的解剖顯微鏡下找出腎神經(jīng)，用蘸取溶于無水乙醇的10%苯酚溶液的棉球反復涂擦腎動脈，持續(xù)2～3 min，采用腎神經(jīng)電刺激的方法評估去腎神經(jīng)支配是否徹底，其余過程參考文獻［5］。假手術組用生理鹽水涂抹腎動脈周圍，此過程避免損傷神經(jīng)。其余過程同前。

1.3 標本采集及保存 大鼠智能無創(chuàng)血壓計tailcuff 法測量大鼠血壓、心率。用無創(chuàng)血壓計的尾部氣囊套在大鼠尾根部的近心端，充分擴張鼠尾血管，待收集脈搏信號出現(xiàn)規(guī)則波形后，充氣加壓至脈搏信號成為一條直線，然后放氣減壓，讀出并記錄收縮壓、舒張壓及心率數(shù)值，每只大鼠測量3 次血壓，取3 次測量的平均值。之后下腔靜脈采血、離心，將血漿和血清收集至EP 管中，于-80℃冰箱冷凍保存，用于血漿神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuronspecific enolase，NSE）、S100B 濃度的測定。采血后迅速摘取右側腎臟及下丘腦室旁核組織，組織處理好后于-80℃冰箱冷凍保存，用于后續(xù)檢測。

1.4 檢測血漿中NSE、S100B,腎臟NE 以及下丘腦AngII 含量 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)法檢測靜脈血中NSE 含量，按照ELISA 試劑盒說明進行。

1.5 檢測下丘腦AT1R mRNA 的含量 目的基因引物由上海生工使用Beacon Designer7 軟件設計合成，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glycer-aldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）為內參。AT1R 正向：5′-AAGAATCCAAGATGACTGCCC-3′，AT1R 反向：5′-TCCCACCACAAAGATGATGCTG-3′；GAPDH正向：5′- GTTACCAGGGCTGCCTTCTC -3′，反向：5′-GGGTTTCCCGTTGATGACC-3′。將各樣品cDNA稀釋10 倍后取2 μL 作模板，分別用目的基因引物和內參基因引物進行擴增。在60～95℃進行溶解曲線分析。用ABI 7900 Real-Time PCR system 軟件處理數(shù)據(jù)，計算最低循環(huán)數(shù)Ct 值。采用2-△△ct法計算出各樣品的目的基因相對定量結果。

1.6 統(tǒng)計學方法 本研究數(shù)據(jù)采用SPSS22.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析；計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示。兩組間均數(shù)比較用t 檢驗；多組間均數(shù)比較釆用單因素方差分析；變量間的相關性用直線相關分析。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠基礎數(shù)據(jù)的比較 DC 組與NC 組、DO1組與DS1組、DO6組與DS6組心率、體質量比較差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）；DC 組大鼠收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）明顯高于NC 組；DO1組SBP、DBP 較DC 組 分 別 降 低39.8 mmHg、30.8 mmHg（P ＜0.05）；DO1組SBP、DBP 較DS1組 分 別 降 低38.8 mmHg、29.1 mmHg（P＜0.05），見表1，DO6與DO1組相比SBP、DBP 有所上升，分別上升38.6 mmHg、28.7 mmHg（P＜0.05）。DS6與DS1組相比SBP、DBP有所上升，但是差異沒有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

2.2 各組大鼠血漿去甲腎上腺素(NE)含量 DC 組的NE 含量明顯高于NC 組（P＜0.05），DO1組低于DC（P＜0.05）及DS1組（均P＜0.05），DO6組明顯低于DS6組（P＜0.05），DO6組較DO1組有明顯的升高（P＜0.05），見表2。

表1 各組大鼠心率、體質量、血壓的比較(±s)Tab 1 Comparison of heart rate,body weight,and blood pressure of rats(±s)

注：NC 組：自發(fā)性高血壓大鼠；DC 組：去腎交感神經(jīng)術組；RDN 組：去腎交感神經(jīng)組；DO1：RDN 1 周組；DO6：RDN 6 周組；DS1：假手術組；DS6：假手術6 周組

RDN 組 假手術組DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）體質量/g 256.60±12.31 258.20±11.66 263.20±10.74 329.00±9.65 263.50±11.78 331.10±8.45心率/(bpm) 419±11 418±12 421±9 416±7 419±13 418±12 SBP/mmHg 138.30±10.48 197.80±7.28# 158.00±10.45a 196.60±5.96 196.80±10.3b 205.3±5.90 DBP/mmHg 80.00±10.77 148.30±6.40# 117.50±5.35 146.20±6.74 146.60±6.76 154.20±6.06組別 NC 組（n=12） DC 組（n=12）

表2 各組大鼠NE 的比較(±s)Tab 2 Comparison of NE in each group of rats(±s)

表2 各組大鼠NE 的比較(±s)Tab 2 Comparison of NE in each group of rats(±s)

注：DC 組與NC 組比較，aP＜0.05；DO1 組與DC 組比較，bP＜0.05；DO1 組與DS1 組比較，cP＜0.05；DO6 組與DS6 組比較，dP＜0.05

RDN 組 假手術組DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）NE/（pg/mL） 92.9±5.70 209.2±8.12a 189.7±7.81b 217.8±2.09 229.1±5.85c 276.6±8.35d組別 NC 組（n=12） DC 組（n=12）

2.3 下丘腦血管緊張素II(AngII)、AT1R mRNA 含量的變化 DO1組AngII、AT1R mRNA 明顯低于DC組、DS1（均P＜0.05），DO6組明顯低于DS6組（P＜0.05），DO6組高于DO1組（P＜0.05）。DC 組下丘腦AT1R mRNA 表達較NC 組明顯升高（P＜0.05），見表3。

表3 各組大鼠下丘腦AT1R mRNA、AngⅡ表達的比較(±s)Tab 3 Comparison of AT1R mRNA and AngⅡexpression in the hypothalamus(±s)

表3 各組大鼠下丘腦AT1R mRNA、AngⅡ表達的比較(±s)Tab 3 Comparison of AT1R mRNA and AngⅡexpression in the hypothalamus(±s)

注：DO1 組與DC 組、DS1 組和DO6 組相比，均P＜0.05；DO6 組與DS6 組相比，P＜0.05

RDN 組 假手術組DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）AT1R mRNA/（pg/mL） 0.56±0.02 1.03±0.03 0.74±0.04 1.08±0.06 1.17±0.06 2.01±0.05 ANGII/（pg/mL） 20.38±1.58 40.71±1.78 34.39±2.17 42.12±1.25 44.41±1.05 60.34±1.37組別 NC 組（n=12） DC 組（n=12）

2.4 各組大鼠血漿NSE、S100B 含量變化 DO1組大鼠NSE 及S100B 較DC 組及DS1組明顯升高（均P＜0.05）；DO6組血漿NSE 及S100B 與SHR 基線組及DS6組比較無統(tǒng)計學差異（均P＞0.05），DC 組血漿NSE 及S100B 水平明顯高于NC 組（P＜0.05）；DO6組較DO1組NSE 及S100b 含量有所回升（P＜0.05），見表4。

表4 各組大鼠血漿NSE 及S100B 比較(±s)Tab 4 Comparison of plasma NSE and S100B of rats(±s)

表4 各組大鼠血漿NSE 及S100B 比較(±s)Tab 4 Comparison of plasma NSE and S100B of rats(±s)

注：DC 組與NC 組比較，aP＜0.05；DO1 組與DC 組比較，bP＜0.05；DO1 組與DS1 組比較，cP＜0.05

RDN 組 假手術組DO1（n=6） DO6（n=6） DS1（n=6） DS6（n=6）NSE/（ng/mL） 7.30±0.69 9.36±0.84a 13.96±0.72bc 11.31±0.29 9.44±0.27 10.19±0.88 S100B/（ng/mL） 0.59±0.07 0.84±0.02a 1.30±0.17bc 0.91±0.08 0.85±0.04 0.86±0.06組別 NC 組（n=12） DC 組（n=12）

2.5 血漿NSE、S100B 與腎臟NE 的相關性分析 直線相關分析示:SHR 大鼠血漿NSE 與腎臟NE 呈負相關(rs=-0.82，P＜0.01)；血漿S100B 與腎臟NE 亦呈負相關(rs=-0.934，P＜0.01)。

3 討論

2019 年公布的一項數(shù)據(jù)分析表明RDN 可以顯著降低患者收縮壓、舒張壓及24 h 動態(tài)血壓［7］。但RDN 的具體降壓作用機制不甚明了。本研究組采用化學消融的方式損傷大鼠腎臟交感神經(jīng)，希望通過對中樞AT1mRNA、AngⅡ表達的監(jiān)測以說明RDN術對于機體的中樞水平也有降低血壓的作用。

本實驗通過對大鼠血漿NE 在RDN 前后含量的變化的觀察，發(fā)現(xiàn)RDN 術后（DO1組）大鼠的血漿NE 含量下降明顯。而NE 是由腎交感神經(jīng)釋放的，是反映腎交感神經(jīng)活性的最直觀的指標。腎交感神經(jīng)在高血壓的發(fā)病機制中起著十分重要的作用，其過度激活已經(jīng)被認為是高血壓發(fā)生和發(fā)展的重要機制之一，腎交感神經(jīng)作為抑制交感神經(jīng)的過度激活為治療高血壓的落腳點，越來越得到大家的青睞。腎交感神經(jīng)不僅支配腎血管，還支配腎小管上皮的細胞和近球小體，通過釋放NE，作用于腎臟表面的α 受體，從而引起腎血流量減少，腎小球濾過率下降；當其作用于近球細胞的β 受體，近球小體就會釋放腎素，血循環(huán)中的AngII 和醛固酮增加，腎小管重吸收Na+增加，這在血容量增大導致的高血壓中發(fā)揮關鍵作用［8］。AngII 和AT1R 是RAAS 的重要組分。近年來發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)中也有RAAS 各種組成成分。而本實驗中，RDN 組中DO1組與假手術組及DC 組相比下丘腦AngII、AT1R mRNA 明顯降低。Masaaki等［10］通過實驗發(fā)現(xiàn)，進行過RDN 的CKD 小鼠 的 下丘腦室旁核（raraventricular nucleus，PVN）獲得的輸入信號減少，腎交感神經(jīng)活性（renalsympathetic nerve activity，SNA）隨之減低，小鼠的收縮壓/舒張壓明顯減低［9］。表明RDN 可能通過減少傳入PVN 的沖動，從而減弱PVN 對SNA、AngII 產(chǎn)生的影響，降低下丘腦中AngII 及AT1R 的水平，從而降低高血壓患者血壓水平［10］。由于心率對于血壓影響較大，Qiu 等［11］的實驗也表明進行過RDN 的鼠24 h 動態(tài)血壓與心率沒有明顯的關系，表明RDN 降低血壓不是依賴于降低心率。

本實驗中NSE 是一種神經(jīng)元和神經(jīng)內分泌細胞所特有的酸性蛋白酶，是神經(jīng)細胞分化成熟或損傷的標志，其含量與神經(jīng)細胞損傷相關。國內已有江鳳林等［12］對高血壓犬行RDN 術，觀察到犬血漿NSE 水平顯著升高，血壓顯著而持久的下降［13］。而本研究也得到了相似的結果。表明血漿中NSE 含量變化可能與腎交感神經(jīng)元破壞的程度有關。而本研究中檢測的另外一個指標S100B 蛋白，是外周神經(jīng)組成部分之一施萬細胞（schwann，又名雪旺細胞）的標志蛋白。施萬細胞作為一種神經(jīng)膠質細胞，能分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子，促進受損神經(jīng)元的修復及軸突的再生。S100B 在血漿中含量的多少則反映施萬細胞破壞的程度。在腦卒中領域，NSE 和S100B 往往被認為是反映中樞神經(jīng)損傷的生物標志物［14］。本實驗中DO1組S100B 較DC 組、NC 組明顯升高。說明S100B 也能在一定程度上反映腎交感神經(jīng)損傷的程度。

本實驗結果還能發(fā)現(xiàn)D06組AngII、NE 較DO1組有所升高；NSE、S100B 較DO1組有明顯的回落。究其原因，可能為實驗操作時，肉眼識別的交感神經(jīng)數(shù)目有限，沒能將腎交感神經(jīng)消融完全。所以在消融了一部分神經(jīng)后，引起了NE、AngII 的降低，NSE、S100B 也因為化學消融損傷了細胞所以有一過性升高。但在這之后，也就是腎交感神經(jīng)代償性的生長后，NE、AngII 又出現(xiàn)了升高。而血漿中NSE、S100B隨著機體代謝，含量變少，僅殘存機體里的是仍舊未代謝完的。

從本研究的結果可以看出：（1）RDN 可顯著性降低血壓，并不依賴于心率的降低；（2）RDN 可顯著的降低腎臟NE 水平；（3）RDN 可降低下丘腦AT1R mRNA、AngII 的表達。因此，筆者推測RDN 可通過降低下丘腦AngII、AT1R 水平，以及降低外周交感神經(jīng)活性，即降低腎臟NE 水平，降低血壓。

另外，本次研究存在一些局限性，包括：（1）未能通過油紅染色等直觀的實驗方法反映腎臟交感神經(jīng)細胞及腎動脈的RDN 前后對比；（2）觀察時間不夠長，因此不能評估RDN 對于高血壓動物的更長遠影響；（3）對大鼠的腎動脈交感神經(jīng)消融不完全。

綜合上述結果可以推測：第一，RDN 可能是通過下調下丘腦AngII 和AT1R mRNA 的表達降低交感神經(jīng)活性，從而降低血壓。此結果在本研究組RDN對心力衰竭的相關研究中也得到了證實。第二，NSE、S100B 水平或許可作為判斷RDN 治療成功與否的標志。第三，RDN 后，動物的腎交感神經(jīng)消融得不夠徹底時，可能在一段時間后，腎交感神經(jīng)會發(fā)生代償生長。