超高效液相色譜-串聯質譜法測定豬組織中泰拉霉素及其代謝物殘留量

李 建，魏紫嫣，王佳雅，張晶晶，黃川鄰，王利丹，孫志文*，葉能勝*

(1.國家糧食和物資儲備局科學研究院，北京 100037；2.北京市獸藥監察所，北京 102629；3.首都師范大學化學系，北京 100048；4.中國合格評定國家認可委員會，北京 100062)

泰拉霉素(tulathromycin)又名土拉霉素，是一種新近上市且為動物專用的大環內酯類半合成抗生素，主要用于治療由胸膜肺炎放線桿菌、巴氏桿菌和支原體等引起的家畜呼吸系統疾病[1]，我國農業部在2008年第957號公告中首次允許泰拉霉素在動物生產中使用，主要用于牛和豬呼吸系統疾病的防治[2]。目前，我國將泰拉霉素作為專用抗生素在牛、豬養殖過程中，用以防治由敏感菌引起的牛、豬呼吸系統感染性疾病以及由牛莫拉氏菌引起的牛傳染性角膜結膜炎[3]。華南農業大學國家殘留基準實驗室進一步對泰拉霉素在豬體內的藥物動力學及生物利用度等指標[4-5]進行了系統研究以指導養豬行業的合理用藥，同時國外相關研究針對動物用藥后藥物在血漿中分布情況[6-9]及藥代動力學[10]也進行了分析。研究表明，隨著用藥時間的延長以及用藥量的不斷增大，泰拉霉素在動物體性組織中會出現不同程度的藥物殘留[11-16]，歐洲藥品評價局(EMEA)相關資料(EMEA/MRL/894/04)表明：泰拉霉素在豬體內的殘留量由皮膚+脂、肌肉、腎臟、注射部位到腎臟逐漸增高，并給出了豬組織中的最高殘留限量(MRL)：皮膚脂肪100 μg/kg，肝臟3000 μg/kg，腎臟3000 μg/kg。我國目前還并沒有泰拉霉素殘留檢測相應的國家標準，基于高效液相色譜-串聯質譜法檢測泰拉霉素的研究主要集中在雞肉[17]、豬肉[18]以及牛肉[19]等動物組織[20]，對于豬組織中泰拉霉素的分析檢測研究的報道很少[21]。另有針對動物組織中泰拉霉素及其代謝物的樣品前處理技術的報道，主要有加壓液相萃取[22]和分子印跡固相微萃取技術[23-24]等。本研究基于超高效液相色譜-串聯質譜技術建立了豬組織中泰拉霉素及其代謝物的分析檢測方法，采用基質外標法定量，分別對豬肉、肝臟、腎臟中的泰拉霉素及其代謝物進行了分析檢測。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

1.1.1 儀器 超高效液相色譜-串聯質譜儀(美國Waters公司)；勻漿儀(中國安信匯康)；電子分析天平(北京賽多利斯有限公司)；高速冷凍離心機(日本HITACHI 公司)；氮吹儀(Organomation Associates公司)；溶劑過濾器(美國PALL公司)；旋渦混合儀(德國IKA公司)。

1.1.2 試劑 泰拉霉素及其代謝物標準品由艾美科健(中國)生物醫藥有限公司提供，含量分別為99.5%和98.5%；乙腈、甲醇、甲酸，購自美國Thermo Fisher Scientific公司，均為質譜純；MCX固相萃取柱(60 mg/3 mL)，購自美國Waters公司；正己烷、氨水，分析純，購自北京化工試劑廠。其他試劑均為分析純。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理 稱取試料2±0.02 g于50 mL離心管內，渦旋混合，加入提取液(乙腈+0.1%甲酸水，7+3)10 mL，震蕩10 min，10000 r/min離心5 min，取上清于另一干凈50 mL離心管中，剩余殘渣重復提取，加入5 mL提取液，重復提取一次，合并上清液。在以上提取液中加入10 mL正己烷，振蕩10 min，5000 r/min離心5 min，棄去正己烷層，下層溶液作為備用液。

MCX固相萃取柱依次用甲醇3 mL、2%甲酸水3 mL活化，取全部備用液過柱，依次用2%甲酸水3 mL、甲醇3 mL淋洗，然后用5%氨化甲醇2 mL洗脫，并收集洗脫液于10 mL離心管中，于40 ℃氮氣吹干。加10%甲醇水溶液(含0.5%甲酸)1.0 mL復溶，充分漩渦混勻，14000 r/min離心20 min，上清液過0.22 μm濾膜后，供超高效液相色譜-串聯質譜儀測定。高濃度樣品稀釋后上機檢測。

1.2.2 液相色譜參考條件 液相色譜條件：BEH C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.7 μm)；流動相：A：乙腈；B：0.1%甲酸水；流速：0.3 mL/min；進樣量：5 μL；柱溫：30 ℃，梯度洗脫程序見表1。

表1 液相色譜梯度洗脫條件Tab 1 Gradient elution conditions of liquidchromatography

1.2.3 質譜參考條件 離子源：電噴霧離子源(ESI)；檢測方式：多反應監測(MRM)；掃描方式：正離子掃描；電離電壓：3.0 kV；源溫：150 ℃；霧化溫度：450 ℃；錐孔氣流速：150 L/h；霧化氣流速：700 L/h。定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量見表2。

1.2.4 標準曲線繪制 分別精密稱取適量泰拉霉素、泰拉霉素代謝物標品，用乙腈溶解配制成質量濃度為1 mg/mL貯備液，再吸取不同體積貯備液配制6個不同濃度的基質標準工作液(5，10，50，100，200，500 μg/kg)，以濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

表2 泰拉霉素及其代謝物質譜參數Tab 2 Mass spectrometric determination paramete of tulathromycin and its metabolite

2 結果與分析

2.1 線性范圍 采用6個不同濃度5，10，50，100，200，500 μg/kg基質標準工作液，以濃度為橫坐標，對應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結果表明，在5～500 μg/kg的濃度范圍內泰拉霉素及其代謝物色譜峰面積與濃度呈良好線性相關，相關系數均>0.99。泰拉霉素及其代謝物的標準曲線見表3。

表3 泰拉霉素及其代謝物豬組織基質匹配標準曲線Tab 3 The matrix standard curve of tulathromycin and its metabolite for pork, pig liver and kindey

2.2 檢測方法靈敏度 方法檢出限(LOD)和定量限(LOQ)：按照藥物選擇離子響應色譜峰信噪比S/N>3(按PtP算)確定檢出限；按照藥物選擇離子響應色譜峰的信噪比S/N>10(按PtP算)確定定量限。

添加適量標準溶液于2 g空白試樣中，分別制備得到5 μg/kg和10 μg/kg的添加樣品(豬肉：2 μg/kg)，經前處理后檢測，檢出限(LOD)滿足信噪比 S/N=3，定量限(LOQ)滿足信噪比S/N =10，該方法檢出限為5 μg/kg(豬肉：2 μg/kg)，定量限為10 μg/kg。

2.3 實際樣品檢測應用 在上述優化最佳條件下，將本方法應用于豬肉、肝臟和腎臟中泰拉霉素及其代謝物的分析檢測，并取得了較好的應用效果。泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖、豬肉、肝臟和腎臟空白色譜圖以及豬肉、肝臟和腎臟添加特征色譜圖見圖1～圖7。

圖1 10 ng/mL泰拉霉素及其代謝物標準溶液特征離子色譜圖Fig 1 The chromatogram of tulathromycin and its metabolite for standard solution (10 ng/mL)

圖2 泰拉霉素及其代謝物豬肉空白特征離子色譜圖Fig 2 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pork

圖3 豬肉添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 3 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pork(10 μg/kg)

圖4 泰拉霉素及其代謝物豬肝臟空白特征離子色譜圖Fig 4 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig liver

圖5 豬肝臟添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 5 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig liver(10 μg/kg)

圖6 泰拉霉素及其代謝物豬腎臟空白特征離子色譜圖Fig 6 The blank chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig kidney

圖7 豬腎臟添加10 μg/kg泰拉霉素及其代謝物特征離子色譜圖Fig 7 The spiked chromatogram of tulathromycin and its metabolite for pig kidney(10 μg/kg)

2.4 檢測方法準確度和精密度 分別準確稱取空白樣品2 g，添加一定體積的標準工作溶液，使組織中泰拉霉素及其代謝物濃度分別為10、3000、6000 μg/kg(豬肉、肝臟、腎臟)，按上述樣品前處理方法處理后進行測定，高濃度樣品進行適當稀釋后再測定。一日內每種藥物的每個添加濃度取5個平行樣品分別進行測定，計算回收率和日內相對標準偏差；每個添加濃度設5個平行，每天測定1批，重復測定3 d，計算回收率和日間相對標準偏差。豬組織樣品中泰拉霉素及其代謝物在10～6000 μg/kg添加水平內的平均回收率在72.6%～105.8%之間，日內相對標準偏差在0.5%～12.1%之間，日間相對標準偏差在2.9%～8.1%之間。具體結果詳見表4～表6。

表4 豬肉中添加回收率和相對標準偏差Tab 4 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pork

表5 豬肝臟中添加回收率和相對標準偏差Tab 5 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pig liver

表6 豬腎臟中添加回收率和相對標準偏差Tab 6 The average recoveries and relative standard deviations (RSDs) of tulathromycin and its metabolite for pig kidney

3 討論與結論

3.1 樣品提取條件優化 泰拉霉素為弱堿性化合物，易溶于酸性溶液和極性溶液，因此，在樣品前處理過程中分別考察了乙腈、0.1%甲酸乙腈、乙腈+0.1%甲酸水(7+3)和0.1%甲酸水四種樣品提取溶液對豬組織中泰拉霉素的提取效率。實驗中乙腈和0.1%甲酸乙腈加入豬組織中會立即產生蛋白質凝集沉淀，不宜于組織的渦旋分散，從而影響泰拉霉素的提取效率；0.1%甲酸水雖然能夠使豬組織渦旋分散，但是無法使蛋白質變質沉淀，提取液渾濁不利于后續的凈化操作；乙腈+0.1%甲酸水(7+3)不僅能夠使豬組織渦旋分散，而且能夠使蛋白質變質沉淀，提取上清液雜質較少，同時正己烷除脂能夠使上清液更加干凈，有利于后續提取液的凈化過程。因此，本實驗的樣品提取液最終選擇乙腈+0.1%甲酸水(7+3)。

3.2 樣品凈化條件優化 由于泰拉霉素含有3個氨基基團，具有一定的離子性，因此，本實驗進一步采用陽離子固相萃取柱對提取液進行凈化。實驗中分別選取了弱陽離子交換柱(WCX)、混合型陽離子交換柱(MCX)和強陽離子交換柱(SCX)對泰拉霉素的提取效果進行了考察，結果表明：SCX柱和WCX柱對泰拉霉素的回收率均低于MCX柱(圖8)，這可能是因為SCX柱是強陽離子交換柱，對泰拉霉素的保留太強，導致泰拉霉素的回收率偏低；而WCX柱屬于弱陽離子交換柱，對泰拉霉素的保留不強而導致回收率偏低。MCX柱屬于混合陽離子交換柱，兼具離子交換和反相的特點，對堿性化合物具有較高的選擇性和靈敏度，因此，本實驗最終選擇MCX固相萃取柱用于樣品凈化。

圖8 三種不同陽離子交換柱對泰拉霉素及其代謝物的回收率(三種交換柱中第一個均為泰拉霉素，第二個均為泰拉霉素代謝物)Fig 8 The recoveries of tulathromycin and its metabolite for three different cation exchange columns

3.3 色譜條件優化 本實驗采用BEH C18反相色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)進行了色譜條件優化，可使目標物在較短的時間內得到很好的色譜圖。實驗中以乙腈-0.1%甲酸水為流動相，對不同梯度條件下的色譜保留進行了考察，最終確定了泰拉霉素及其代謝物的色譜分離條件。

3.4 質譜條件優化 泰拉霉素為堿性化合物，容易獲得一個氫離子而帶正電，本實驗采用電噴霧離子源進行正離子掃描，先通過一級全掃描質譜得到準分子離子峰([M+H]+)，隨后進行二級質譜掃描分析，通過優化毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞電壓等參數，最終確定了泰拉霉素及其代謝物的定性、定量離子對和錐孔電壓及碰撞能量。

本研究建立了豬組織中泰拉霉素及其代謝物殘留的分析檢測方法，樣品經提取、凈化等處理，超高效液相色譜串聯質譜分析檢測。結果表明，該方法快速、簡便，靈敏度高，重現性好，能夠滿足對豬肉、肝臟和腎臟中泰拉霉素及其代謝物的殘留分析檢測，同時也為相關檢測單位提供了技術支持。