FGM發酵黃芪液安全性初步評價

王 恒，張 宏，張 凱，王 磊，張 康，馬玉俊，李建喜，楊孝樸*，張景艷、*

(1.甘肅農業大學動物醫學院，蘭州 730070；2.甘肅省獸藥飼料監察所，蘭州 730000；3.中國農業科學院蘭州畜牧與獸藥研究所，蘭州 730050)

發酵(Fermentation)是一種從原料或低級底物中產生高價值產品的微生物驅動過程。更具體地說，發酵在微生物酶的作用下分解或轉化非所需底物為可共處的成分，通過生產和改進具有生物活性的化合物，進而改善底物性質[1]。傳統中藥發酵一般多在天然的條件下進行的，而現在的中藥發酵制藥技術是在充分吸收了近幾年新興的微生態學和生物工程學的研究成果而逐漸形成的。其先進發酵工藝特點是：以優選的有益菌群中的一種或幾種，加入中藥提取液中，再按照現代發酵工藝制成產品，它是一種含有中藥活性成分、菌體及其代謝產物的全組分發酵液的新型中藥發酵加工制劑[2]。中藥發酵具有可使活性成分大量釋放、產生新的活性成分、降低毒副作用等優點。同時，乳酸菌具有巨大的生物轉化功能，菌體本身和其代謝產物也具有很好的益生特性。因此，開發新型乳酸菌和中藥合生元微生態制劑十分必要并具有廣闊前景。

實驗利用分離于土雞盲腸的厭氧菌株FGM(GenBank accession number JX435470，專利號：ZL20120141827.5)為發酵菌株，在體外建立了發酵黃芪及多糖提取的技術工藝，結果顯示多糖提取率是發酵前的2.7倍[3、4]。結合16S rDNA 序列分析、形態學觀察及生理生化鑒定，確定FGM菌株為芽孢桿菌綱，乳桿菌目，鏈球菌科，鏈球菌屬非解乳糖鏈球菌(streptococcus)[5]。目前研究表明，發酵黃芪具有免疫調節[6,7]、保肝[8]、抗氧化[9,10]、抗糖尿病[11]、抗腫瘤[12]及抗疲勞保健[13]等的活性。此外，秦俊杰[14]等發現，黃芪和黨參發酵產物具有調節黃羽肉雞生化指標的作用，對機體生理機能和促進生長發育方面具有實踐意義。因此，為進一步開發酵黃芪液和發酵黃芪多糖產品，對雞腸道源FGM菌株及黃芪發酵物進行安全性評價是非常有必要的。本試驗對FGM菌液和FGM發酵黃芪液進行了急性毒性試驗，測定了小鼠體重，臟器指數、血常規以及病理組織學觀察，旨在明確FGM發酵黃芪液的安全性。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑 厭氧培養箱1029型((Thermo Fisher公司)；Sysmex pocH- 100 iv全自動三分類血液分析儀(日本希森美康株式會社)；Leica全自動組織切片系統(德國Leica公司)；奧林巴斯研究級倒置顯微鏡1X71(日本奧林巴斯株式會社)。苦味酸、生理鹽水、10 %中性福爾馬林、石蠟(熔點52～54 ℃、54～56 ℃)、梯度酒精、冬青油、二甲苯、蘇木素、伊紅、中性樹膠等。

1.2 試驗動物 清潔級昆明小鼠，體重18～22 g，雌雄各半，購自中國農業科學院蘭州獸醫研究所；全價小鼠顆粒飼料購于蘭州大學GLP試驗樓。

1.3 菌懸液和發酵液的制備 快速復蘇凍存的菌株FGM，接種于50 mL的MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養24 h。將復壯的細菌按2 %(v/v)的量接種到新的MRS肉湯中，37 ℃厭氧培養。用血細胞計數器對細菌計數，調整菌液濃度為109CFU/mL，使菌體均勻分散，制成菌懸液備用。

菌株FGM活化傳3代后分別按體積分數3 %(菌量約4 ×108個/mL)的接菌量接入100 mL發酵培養基(已用Na2CO3調初始pH值至7.4)中，100 r/min、37 ℃厭氧發酵培養48 h。發酵結束后，取發酵液備用。

1.4 試驗動物分組及觀察指標 常規觀察5 d后，將小鼠隨機分為3組：FGM活菌組、FGM發酵液組、陰性對照組。每組10只，雌雄各半。禁食12 h稱重，各組小鼠每次灌胃0.5 mL，連續3 d，觀察7 d，陰性對照組同時給予等量的生理鹽水。依據表1的評判標準記錄小鼠的日常采食飲水、死亡情況、被毛色澤、精神狀態、糞便性狀和精神狀況等表現。在試驗第8 d，稱取各組小鼠體重，對比試驗前后小鼠體重變化；摘眼球采血，肝素鈉抗凝全血后，檢測血液生理指標：白細胞(WBC)、紅細胞(RBC)、血紅蛋白(HGB)、紅細胞比容(HCT)、平均血紅蛋白濃度(MCHC)；剖檢小鼠，觀察各組織臟器的外觀和顏色等特征，對心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟進行稱重，并計算臟器系數(臟器系數=臟器重量×100/體重)。

表1 小鼠一般健康體征外觀評價Tab 1 Features of general health appearance score

1.5 病理學檢查 取心臟、肝臟、脾臟、腎臟和小腸等臟器組織，用10 % 的中性福爾馬林溶液浸泡固定臟器，制作石蠟切片，蘇木精-伊紅(H.E.)染色后，進行病理組織學檢查。

1.5.1 組織切片制備方法

1.5.1.1 取材與固定 用銳利的刀片將臟器組織修為 5×5×3 mm 左右的組織塊。經生理鹽水清洗后，用紗布包裹小心放入 10 % 中性福爾馬林中進行固定，做好各組標記。

1.5.1.2 脫水與透明 取出固定好的組織塊，裝入包埋盒，流水緩慢沖洗3 h，置換出組織中的福爾馬林固定液，然后將包埋盒放入盛有不同濃度乙醇的脫水缸中，進行逐級梯度脫水，脫水步驟依次為：

70% 乙醇Ⅰ60 min→70 % 乙醇Ⅱ 60 min→80 % 乙醇Ⅰ過夜 →80 % 乙醇Ⅱ 60 min→90 %乙醇Ⅰ 60 min→90 % 乙醇Ⅱ 60 min→95 % 乙醇Ⅰ 60 min→95 % 乙醇Ⅱ 60 min→100 % 乙醇Ⅰ 60 min→100 % 乙醇Ⅱ 60 min→100 % 乙醇 Ⅲ 60 min脫水步驟完成后，放入冬青油中過夜，對組織塊進行透明處理，透明過程的具體步驟如下：

冬青油Ⅰ 95 min→冬青油Ⅱ 95 min→冬青油 Ⅲ 過夜

1.5.1.3 浸蠟與包埋 透明操作結束后，將包埋盒取出，放入融好的石蠟中進行浸蠟處理，操作步驟依次為：

石蠟Ⅰ(熔點52～54 ℃)：二甲苯(1∶1) 60 min→石蠟Ⅱ(熔點 54～56 ℃) 60 min→石蠟Ⅲ(熔點54～56 ℃)60 min

將浸好蠟的組織塊從包埋盒中取出，放入包埋槽內，快速加入 54～56 ℃的石蠟，進行組織包埋。包埋操作要快，以防止組織塊因局部冷卻速度不同、溫度不均而與蠟塊出現分層，影響切片質量。

1.5.1.4 修塊與切片 從包埋槽中取出冷卻的蠟塊，簡單修整，去掉組織周圍多余的石蠟，將蠟塊固定在切片機的卡槽中，進行切片操作，先進行 20 μm 粗切，使蠟塊表面平整光滑，然后再調整切片厚度到 4～6 μm，連續切片。用小鑷子夾起切出的組織片，小心放入攤片烤片機的水槽內，使蠟片在 45～49 ℃的溫水中緩慢展開，然后用經多聚賴氨酸處理過的載玻片輕輕挑起組織切片，注意組織部分不要重疊，不要有氣泡，將載玻片放在攤片烤片機的烤片區，37 ℃烤片過夜。

1.5.1.5 脫蠟 二甲苯Ⅰ10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→100 % 乙醇Ⅰ 5 min→100 %乙醇Ⅱ 5 min→95 %乙醇Ⅰ 5 min→95 %乙醇Ⅱ 5 min→80 %乙醇 5 min→70 %乙醇 5 min→蒸餾水 2 min

1.5.1.6 染色封片鏡檢 染色后用濾紙擦去組織周圍多余二甲苯，在組織上滴一滴中性樹膠，蓋上蓋玻片(避免氣泡)，37 ℃烤片過夜，最后在顯微鏡下觀察組織病理變化情況。

1.5.2 H.E.染色方法 蘇木素 5 min→蒸餾水沖洗 10 s→分化 (1 %鹽酸乙醇，用 70 %乙醇配制)10 s→自來水返藍 15～20 min→水溶性伊紅 3 min→70 %乙醇 5 s→80 %乙醇 10s→95 %乙醇Ⅰ 2 min→95 %乙醇Ⅱ 2 min→100 %乙醇Ⅰ 5 min→100 %乙醇Ⅱ 5 min→100 %乙醇Ⅲ 5 min→二甲苯Ⅰ 10 min→二甲苯Ⅱ 10 min→二甲苯Ⅲ 5 min

1.6 數據統方法 所有數據均以平均值±標準差表示，應用SPSS 17. 0 軟件進行方差分析，P<0. 05為差異顯著，P< 0. 01為差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 死亡情況與一般體征 在試驗期間，各組小鼠采食采水正常，兩眼有神，警惕性高，運動情況和精神狀態良好，無異常分泌物出現，且沒有死亡病例。對照表1的評判標準可知，各組小鼠的一般健康體征外觀等級相同，均為Ⅰ級。

2.2 體重變化 如表2所示，各組小鼠體重增長和波動在正常范圍內，其中陰性對照組體增重最高，FGM發酵液組和活菌組次之。但是通過方差分析可知，各實驗組小鼠的體重變化差異不顯著(P> 0.05)。因此，判定FGM菌株及其發酵黃芪液對小鼠體重無影響。

表2 菌懸液和發酵液對小鼠體重的影響(x±s，n=10)Tab 2 The effect of bacterial suspension and fermentation broth on the mice body weight

2.3 臟器系數 剖解后肉眼觀察試驗小鼠的臟器，發現各組小鼠主要器官色澤正常，位置、形狀與體積均正常，主要器官之間無腫大、粘連、包塊等病理變化，胃、腸未見潰瘍和出血點。如表3所示，各組小鼠的心臟、肝臟、脾臟、肺臟、腎臟及胸腺的臟器系數，與陰性對照組相比差異均不顯著(P> 0.05)，且均在正常范圍內。此外，FGM活菌及發酵液組小鼠免疫器官(脾臟和胸腺)的臟器系數高于陰性對照組。結果提示，FGM菌株及其發酵黃芪液對小鼠組織無不良影響。

表3 菌懸液和發酵液對小鼠臟器系數的影響(x±s，n=10)Tab 3 The effects of bacterial suspension and fermentation broth on the organ index of mice

2.4 血液學指標 外周血紅白細胞、紅細胞相關參數是反映小鼠免疫系統和炎癥損傷的重要指標。本試驗中，FGM菌懸液組和FGM發酵液組小鼠血液中RBC、WBC、HGB、HCT、MCHC數值有一定波動，但與陰性對照組小鼠相比差異均無統計學意義(P> 0.05)，具體統計結果見表4。結果提示，FGM菌株及其發酵黃芪液對小鼠血液主要成分無不良影響。

表4 菌懸液和發酵液對小鼠血液學指標的影響(x ± s，n=10)Tab 4 The effects of bacterial suspension and fermentation broth on the haematological index of mice

2.5 病理變化 文中圖1、圖2、圖3分別為陰性對照組、FGM活菌組和FGM發酵液組的組織切片鏡檢結果。由圖可知：各試驗組小鼠心臟組織結構清晰完整，心肌纖維排列整齊，心肌纖維細胞分布均勻，肌纖維染色均勻，未發現異常病變；肝臟結構正常，肝細胞呈梁索狀，以中央靜脈為中心放射狀整齊排列，無充血水腫和變性壞死現象；腎臟組織正常，腎小體及腎小管結構完整，細胞核分布均勻，無水腫和出血現象。腸道絨毛結構完整，固有層和粘膜上皮結構正常，中央脈管束結構清晰，鏡下無可見病理變化。

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖1 陰性對照組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 1 Pathological sections of major organs on NG

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖2 FGM活菌組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 2 Pathological sections of major organs on FGM

a：心臟；b：肝臟；c：小腸；d：腎臟。a: Heart; b: Liver; c: Small intestine;d: Kidney.圖3 FGM發酵液組主要臟器病理切片(H.E×400)Fig 3 Pathological sections of major organs on FAL

3 討論與結論

微生物轉化型中獸藥研發和應用的首要前提和必備條件應是安全性好、無毒副作用。當然，通過微生物二次分解轉化后的發酵中藥也應具備優良的生物學活性和功效。由于此類產品中含有活的細菌菌株，因此在對發酵產品進行安全性評價的同時，也應該考慮發酵菌株的致病性。益生性菌株的安全性是評價菌株生物學特性的關鍵，可以通過臟器指數、半數致死量、體重變化、菌株易位等試驗進行評價[15,16]。王葦[17]等對篩選出的優良芽孢桿菌進行不同劑量菌液分別以不同方式感染小鼠，觀察各臟器病理變化和測定主要臟器指數，結果顯示小鼠臟器無病變，臟器指數無顯著差異(P>0.05)。目前，對植物乳桿菌、糞腸球菌、枯草芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌等獸用益生菌的安全性研究已有報道[18-20]。

非解乳糖鏈球菌最早由Farrow[21]等從豬腸道和雞糞便中分離發現，明確該類細菌為無鞭毛、無溶血性、成對或鏈狀排列、兼性厭氧的乳白色革蘭氏陽性球菌。隨后，它被證明是雞、豬、狗、鴨、鴿子和魚等動物腸道中的主要可培養細菌[22-23]，但是對非解乳糖鏈球菌的安全性評價尚未見報道。利用土雞盲腸源非解乳糖鏈球菌FGM菌株制備的發酵型黃芪既保留了FGM菌株的活性，同時還提升了黃芪的生物學活性。因此，該產品在改善畜禽早期腸道菌群結構、提高抗病性方面具有很好的應用前景。有鑒于此，本研究從發酵菌株和發酵產物2個方面入手，通過比較FGM活菌組、FGM發酵黃芪液組小鼠與陰性對照組小鼠的體增重、血液生理指標和臟器指數的變化，并結合剖檢和病理組織切片觀察，明確了FGM發酵黃芪液及其發酵菌株對小鼠生長情況、血液成分及臟器均無不良影響，安全無毒。本研究為發酵黃芪的開發和應用提供了臨床前毒理學背景信息，也填補了有關非解乳糖鏈球菌的安全性信息，后續研究將依照獸藥研究技術指導進一步開展FGM發酵黃芪液的亞慢性毒性試驗，完善該產品的安全性評價。

FGM發酵黃芪液及其發酵菌株灌服小鼠，對小鼠生長發育情況和主要臟器均無不良影響和毒副作用，表明非解乳糖鏈球菌FGM對小鼠無治病性、可用為發酵菌株；FGM發酵黃芪液安全、可飼喂。