納米二氧化鈦 (nTiO2) 對三角褐指藻 (Phaeodactylum tricornutum) 光合系統的影響

廖興盛，王一翔，陳佐泓，王璞，黃靜穎，朱小山*

1.長沙學院生物與環境工程學院，湖南 長沙 410022；2.清華大學深圳國際研究生院，廣東 深圳 518055

隨著科技的不斷進步，人工納米材料（MNMs）已經在社會經濟發展的各個行業中取得了日益廣泛的應用。2005年到2014年，全球MNMs產品從54種增長到1814種（Vance et al.，2014）。伴隨著MNMs的大規模使用，其環境暴露的風險也隨之升高。據調查，2010年全世界 MNMs的產量約26.0×104—30.9×104t。大約0.4%—7.0%的MNMs會釋放到水環境中（Keller et al.，2013）。MNMs對水生生物的影響已成為環境研究的熱點問題。研究表明，水環境中 MNMs會影響水生生物的生長繁殖（Zhu et al.，2010a），并經食物鏈傳遞到生態系統不同營養級（Mansfield et al.，2015；Zhu et al.，2010b）。

在所有的 MNMs中，納米二氧化鈦（nanotitanium dioxide，nTiO2）的應用相對更加廣泛。截至 2014年，大約 100種納米技術產品使用 nTiO2（Vance et al.，2014），常見的應用包括光催化劑、化妝品、涂料等（Chen et al.，2011；Popov et al.，2005；Wang et al.，2014）。同時，nTiO2也是所有MNMs中產量最大的，其他 MNMs如納米銀的產量只有nTiO2產量的2%。根據調查，70%—80%的nTiO2被用于包括防曬霜在內的個人護理品行業（Piccinno et al.，2012）。而在日常洗漱以及在海灘景區防曬等場景中，個人護理品中的nTiO2有可能直接進入到水體中，對水生生物造成危害。根據模型估計，僅在2010年就有超過15000 t的nTiO2被排入水體之中（Keller et al.，2013；Gottschalk et al.，2009），因此亟需對nTiO2的環境風險進行充分評估。盡管目前已有大量關于nTiO2對浮游植物的毒性研究，但研究結論并不一致，一些研究證實nTiO2降低了藻類生長和總葉綠素含量（Metzler et al.，2011；Wang et al.，2008），而另一些研究卻表明nTiO2對藻類的毒性極低（Griffitt et al.，2010）。這些相反的研究結果表明nTiO2對浮游植物的影響機制仍需深入研究。許多研究者認為nTiO2的毒性影響機制在于其能夠誘導產生 ROS（Ochiai et al.，2010；Aruoja et al.，2009），干擾藻類細胞正常的氧化應激平衡，從而抑制藻類的生長和光合能力（Li et al.，2015），并引起DNA 損傷（Aruoja et al.，2009；Chen et al.，2012；Ma et al.，2012；Melegari et al.，2013）。然而，已有的研究主要關注短期暴露下nTiO2的毒性效應，而對暴露過程中浮游植物的應激反應變化缺乏認識。同時，盡管研究認為nTiO2暴露會干擾浮游植物葉綠體的正常光合活動，但對浮游植物與光合作用相關的基因表達在nTiO2脅迫下的變化研究還不深入。

綜合考慮以上因素，本項研究將觀察三角褐指藻（Phaeodactylum tricornutum）在暴露過程中光合作用途徑相關的生理生化指標的變化，主要是葉綠素a含量、Fv/Fm（PS Ⅱ反應中心的最大光量子產量）、光合作用基因rbcS和LcyB的mRNA表達量的變化，探討nTiO2對海洋微藻的光合毒性效應以及海洋微藻在nTiO2暴露下的響應機制。

1 材料與方法

1.1 實驗生物、材料及儀器

本研究選用的藻種為三角褐指藻購買自上海光語生物科技有限公司。選擇三角褐指藻為受試生物的原因在于三角褐指藻為海洋硅藻，對全球碳循環和硅循環具有重要的作用（Mann，1999）；同時三角褐指藻是模式生物，具有完整的基因組信息（Apt et al.，1997），便于開展相關基因的表達研究。實驗采用的nTiO2（99.8%，粒徑約15 nm）購自埃普瑞復合材料有限公司。超聲波清洗機（KQ2200）購自昆山市超聲儀器有限公司，人工氣候箱（RZH-128A）購自杭州匯爾儀器設備有限公司，浮游植物熒光儀（Phyto-PAM）購買自德國WALZ公司，熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7000）為美國產品。

1.2 培養條件

三角褐指藻在人工氣候箱中進行靜置培養，每天搖晃3次，培養溫度為 (20±1) ℃，光照強度為3000 lx，光照周期為 12 h∶12 h（晝∶夜），所用的培養液為f/2培養基（Guillard et al.，1962）。每6天轉接一次，轉接時的起始濃度為2×104ind·mL-1。實驗用海水采自深圳東涌，并用0.45 μm的濾膜過濾。取過濾海水配制f/2培養液。

1.3 實驗體系

暴露組nTiO2質量濃度設置為5、10、20、50、100 mg·L-1，每個濃度設置3個平行。同時設置nTiO2對照組，即不加納米材料（0 mg·L-1）正常培養的三角褐指藻。取0.2 g nTiO2用f/2培養基定容至0.2 L并超聲波處理30 min作為母液。將母液逐級稀釋配成濃度為暴露濃度兩倍的懸濁液。將4×104ind·mL-1的藻液50 mL移至各個150 mL錐形瓶中，隨后加入配好的nTiO2懸濁液50 mL，得到最終的試驗液。試驗液中藻密度為 2×104ind·mL-1，nTiO2質量濃度為 0、5、10、20、50、100 mg·L-1。隨后每 24 h 測定一次，總實驗周期為120 h。

1.4 葉綠素和Fv/Fm的測定

首先以對數期藻液作為參照對 Phyto-PAM 進行標定。從各處理組和對照組藻液中取樣，避光靜置5 min，測量葉綠素a含量和Fv/Fm。依照nTiO2對三角褐指藻葉綠素a含量影響的結果計算各暴露組在處理24—120 h后的抑制率。公式如下：

式中，In表示葉綠素的抑制率（%）；C0和Cn分別表示對照組和處理組中葉綠素 a的含量（μg·L-1）。

1.5 實時熒光定量 PCR

培養 48 h和 120 h后，分別從對照組和 10 mg·L-1nTiO2暴露組中各取藻液40 mL，12000 rpm離心10 min獲得藻細胞。然后提取RNA，具體方法依據說明書（E.Z.N.A.Total RNA Kit II，Omega）進行。提取 RNA后進行反轉錄獲得與三角褐指藻RNA堿基序列互補的 cDNA。使用實時熒光定量PCR儀（ABI PRISM 7000，美國）進行檢測。相關試劑采用 SYBR Prime RT-PCR Kit（TaKaRa）。反應條件如下：預變性95 ℃，30 s，變性95℃ 5 s，退火和延伸64 ℃ 30 s，共計循環40次。實時熒光定量所用PCR引物序列如表1所示。以同一時間點無nTiO2組中的一個樣品作為對照（即該樣品中目的基因的表達量設定為1），使用2-△△Ct方法計算每個基因的相對表達水平（Livak et al.，2001；Schmittgen et al.，2008）。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in the present study

1.6 統計分析

對照組與暴露組的顯著性差異統計使用 SPSS 20進行單因素方差分析，P＜0.05則認為對照組與暴露組的結果之間存在顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 nTiO2對三角褐指藻葉綠素a含量的影響

nTiO2暴露下的三角褐指藻葉綠素 a相對含量變化如圖1所示，隨著nTiO2暴露濃度的升高，三角褐指藻葉綠素 a含量均有不同程度的下降。100 mg·L-1nTiO2處理組在全部暴露時長下葉綠素a含量均顯著低于對照組。暴露24 h時，對照組的葉綠素a含量顯著高于各個暴露組（P＜0.05）；120 h時，只有100 mg·L-1暴露組的葉綠素a含量顯著低于對照組（P＜0.05）。以對照組、10 mg·L-1和 100 mg·L-1處理組為例，24 h 時 10 mg·L-1和 100 mg·L-1組的葉綠素 a含量分別為對照的 (84.8%±6.6%)和(40.3%±8.2%)。120 h 時 10 mg·L-1和 100 mg·L-1這兩組的葉綠素 a含量分別為對照的 (94.5%±0.3%)和 (88.4%±1.1%)。結果表明，三角褐指藻的葉綠素a含量在 nTiO2暴露下呈現出先下降后上升的恢復趨勢，這與先前研究發現的三角褐指藻細胞生長受nTiO2暴露下先抑制后恢復的現象類似（Wang et al.，2016）。

圖1 不同濃度nTiO2處理24—120 h三角褐指藻葉綠素a的含量Fig.1 The contents of chlorophyll a in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

葉綠素a抑制率如圖2所示，可見24 h和48 h時，暴露組的抑制率較高，且隨著暴露時間的增加抑制率逐漸降低。10 mg·L-1和 100 mg·L-1處理 24 h的抑制率分別為 (15.2%±6.6%)和 (59.6%±8.2%)，120 h 為 (5.5%±0.3%)和 (11.6%±1.1%)，抑制率顯著下降。與此同時我們將所得到的數據進行擬合，各濃度的線性擬合斜率均小于零（表2），進一步說明光合作用抑制率隨暴露時間存在下降趨勢；且nTiO2濃度越高，擬合斜率的絕對值越大，抑制率下降越明顯。

圖2 nTiO2暴露對三角褐指藻生長的抑制率隨時間的變化趨勢Fig.2 Inhibition rate on P.tricornutum growth in response to nTiO2 exposure at various time

表2 不同nTiO2濃度下三角褐指藻生長的抑制率與時間的回歸方程Table 2 Regression equations of inhibition rate in P. tricornutum and time at each nTiO2 concentration

2.2 nTiO2對三角褐指藻光合系統II最大光量子產量（Fv/Fm）的影響

葉綠素熒光是光合作用能量轉換的探針，葉綠素熒光參數Fv/Fm代表光合作用 PS Ⅱ反應中心的最大光量子產量，是測量藻類的生長和光合作用的典型指標（Genty et al.，1989），能夠有效地反映藻類受脅迫的程度。本試驗中，對照組在 72 h之后Fv/Fm達到了最大，說明了這段時間是三角褐指藻進入新的環境時的適應期（圖3a）。暴露組中除去5 mg·L-1以外其他各組48 h的Fv/Fm均顯著低于對照組（P＜0.05）。48 h以后，所有暴露組的Fv/Fm與對照組相比均沒有顯著差異（P＞0.05）。表明三角褐指藻對新的環境出現了適應性。暴露的前期階段nTiO2抑制了三角褐指藻的光合系統中光量子的產量，從而影響了葉綠素的含量。48 h后nTiO2對光合系統II最大光量子產量失去了影響，從而使得三角褐指藻對于環境中的nTiO2脅迫表現出了抗性行為或適應行為。

2.3 nTiO2對三角褐指藻光合色素相關基因表達的影響

由葉綠素a和Fv/Fm的變化趨勢可知，隨著暴露時間延長或者暴露濃度上升，nTiO2對三角褐指藻的抑制作用均呈下降趨勢。這種抑制的減弱作用應該在某些光合色素相關基因的表達水平上有所體現。本實驗選取光合作用相關基因，包括番茄紅素β-環化酶基因（LcyB）、八氫番茄紅素合成酶基因（Psy）、八氫番茄紅素脫氫酶基因（Pds）等類胡蘿卜素合成途徑中的重要基因，以及光合碳同化的關鍵酶核酮糖-1, 5-二磷酸梭化酶/加氧酶（Ribulose-1, 5-bisphophate carboxylase，Ruibsco）小亞基 rbcS。然后檢測其表達水平，從而從基因的層面發掘nTiO2對三角褐指藻的影響。跟據Fv/Fm的結果，當暴露濃度大于等于10 mg·L-1時，各處理組前48 hFv/Fm顯著低于對照（P＜0.05）。但這一差異在72 h后消失，因此本研究選擇10 mg·L-1組在暴露48 h和120 h后進行基因表達分析，結果如圖4所示。10 mg·L-1nTiO2暴露下基因 Psy的表達量在 48 h（第2天）和120 h（第5天）與對照組都沒有顯著性差異（P＞0.05）。在第2天和第5天相同濃度下。Pds的表達也都顯著低于對照（P＜0.05）。LcyB和rbcS是 48 h（第 2天）后表達量顯著地低于對照（P＜0.05），而 120 h（第 5天）表達顯著高于對照（P＜0.05）。LcyB第2天和第 5天的相對表達量分別為對照組的 (30.4%±1.5%)和 (164.1%±7.4%)。rbcS在第2天和第5天相對表達量分別為對照組的(21.2%±7.1%)和 (192.8%±12.2%)。

2.4 nTiO2對三角褐指藻光合系統的影響機制探討

圖3 不同濃度nTiO2處理24—120 h三角褐指藻Fv/FmFig.3 Fv/Fm in treatments with various concentrations of nTiO2 for 24-120 h

MNMs對微藻的生長抑制已經被廣泛報道。在所有的MNMs中，nTiO2被認為對藻類的毒性最低。如在一項關于MNMs對月牙藻（Crescent algal）毒性的相關研究中，與納米氧化鋅和納米氧化銅相比，nTiO2的毒性效應最低（Aruoja et al.，2009），此外 nTiO2的低毒性效應也表現在對擬南芥（Arabidopsis thaliana）部分基因表達的抑制中。據報道，與富勒烯和納米氧化鋅相比，擬南芥受nTiO2影響而下調的基因數量最少（Landa et al.，2012）。已有的報道中，nTiO2對新月菱形藻（Crescent lozenge）的 96 h 的 EC50為 88.78 mg·L-1（Xia et al.，2015），對短凱倫藻（Karenia brevis）和中肋骨條藻（Skeletonema costatum）的72 h的EC50分別為10.69 mg·L-1和 7.37 mg·L-1（Li et al.，2015），對月牙藻的 72 h 的 EC50為 9.73 mg·L-1（Aruoja et al.，2009）。此外，在一項同樣以葉綠素a的含量計算抑制率的研究中，小球藻（Chlorella）和柵藻（Scenedesmus）在 72 h 的 EC50分別為 16.12 mg·L-1和 21.20 mg·L-1。與之相比，本研究通過測定葉綠素a而得到抑制率，在最高濃度100 mg·L-1下，24 h和48 h的抑制率大于50%，而72 h及以后其抑制率就已經低于50%，表明nTiO2對三角褐指藻的抑制效應更低。

圖4 nTiO2對三角褐指藻光合作用相關的基因轉錄的影響Fig.4 Effects of nTiO2 on the transcription of genes related to photosynthesis in P. tricornutum

盡管本研究表明nTiO2對三角褐指藻的抑制不明顯，但抑制效果與暴露時間有緊密的關系。在暴露 24 h（1 d）時 100 mg·L-1nTiO2的抑制率為(59.7%±8.2%)，5 d 后 100 mg·L-1nTiO2的抑制率為(11.6%±1.1%)。而且 10—100 mg·L-1nTiO2暴露 24 h和48 h后Fv/Fm顯著低于對照（P＜0.05），3天后卻與對照無顯著差別（P＞0.05）。Chen et al.（2012）也同樣發現 10 mg·L-1以上濃度的nTiO2在前 12 h顯著地抑制了萊茵衣藻的Fv/Fm，隨后 nTiO2處理組中萊茵衣藻逐漸恢復到對照組的水平。本實驗中nTiO2對三角褐指藻的抑制隨著暴露時間的延長而減弱，而這種逐漸減弱的趨勢可能與三角褐指藻對nTiO2的抗性或適應行為有關。隨著暴露時間的延長，三角褐指藻可能通過某些基因如LcyB和rbcS的上調，抵抗nTiO2的不利影響。

rbcS與 1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶有直接聯系，它是光合作用固定碳的關鍵酶（Miziorko et al.，1983）。已有的文獻表明暴露于 nTiO2的菠菜（Spinacia oleracea）中，Rubisco活性顯著上升（Gao et al.，2008）。本研究顯示三角褐指藻rbcS表達量在2 d時出現顯著下調（P＜0.05），5 d時恢復至正常水平。這與本研究中葉綠素a的變化類似。剛加入nTiO2時，藻中的rbcS對nTiO2比較敏感，表達量降低，藻的光合作用受到抑制。光合作用會產生大量的電子，1, 5-二磷酸核酮糖羧化/加氧酶可以催化光呼吸過程的第一階段，從而猝滅多余的電子，對植物起到保護作用（Niyogi，2000）。因此可以推斷，rbcS由2 d的下調到5 d的上調，一方面表現為藻對nTiO2暴露的適應過程中生物量的累積，另一方面可能表現為光合系統的穩定性提高。

番茄紅素合成β-胡蘿卜素的關鍵基因是 LcyB（Bai et al.，2009）。番茄中LcyB的大量表達會顯著的增加β-胡蘿卜素在番茄中的含量（Wiebke et al.，2009）。β-胡蘿卜素是植物光合系統第二階段的反應中的重要組成部分（Nanba et al.，1987）。此外，nTiO2的存在會導致浮游植物體內活性自由氧的含量上升，產生氧化應激（Li et al.，2015；Wang et al.，2008），而β-胡蘿卜素是有效的活性自由氧猝滅劑（Pinto et al.，2003）。綜上，LcyB由第2天的下調到第5天的上調，一方面可能表現為光合系統II更加穩定，這與光合系統II最大光量子產量的結果相符，另一方面可能表現為抵抗nTiO2所導致的氧化壓力的能力逐漸提升。

3 結論

本研究通過觀察三角褐指藻在nTiO2暴露過程中光合作用途徑相關的生理生化指標的變化，探討nTiO2對三角褐指藻的光合毒性效應以及三角褐指藻在nTiO2暴露下的響應機制，結果發現，（1）nTiO2對三角褐指藻的毒性效應較低，且nTiO2對三角褐指藻葉綠素a相對含量和Fv/Fm的抑制效應隨著時間的延長而衰減，表明三角褐指藻對nTiO2脅迫可能具有適應能力。（2）藻光合色素相關基因rbcS和LcyB可能在三角褐指藻對 nTiO2暴露的抵抗過程中起到了重要的作用。考慮到海洋微藻對于MNMs暴露的抗性，在以后的人工納米材料環境影響評價中可以考慮其對環境的短期和長期效應，并對暴露期間海洋微藻生理活動變化給予更多的關注。