干細胞治療1型糖尿病的研究進展

吳珊珊，顧俊菲，張永明

(1.安徽省第二人民醫院內分泌科，合肥 230041; 2.皖南醫學院第二附屬醫院內分泌科，安徽 蕪湖 241001)

1型糖尿病是一種針對胰島β細胞的自身免疫性疾病，相較于2型糖尿病，患者多飲、多尿、多食和體重減輕的“三多一少”癥狀更為典型，以年輕患者居多，急、慢性并發癥(以酮癥酸中毒、糖尿病腎病以及心血管疾病等為主)的發生率更高，病情進展更快，患者的預后和生存質量也更差。世界范圍內0～20歲的1型糖尿病患者近100萬，且患病人數逐年增多[1]。針對中國人群的研究表明，2010—2013年，中國0～15歲人群1型糖尿病的發病率約為1.93/10萬(95%CI0.83～3.03)[2]。目前針對1型糖尿病的治療方式較為有限，主要是胰島素替代療法，但胰島素替代療法只能補充患者缺失的胰島素，并不能從根本上恢復胰島功能，從而治愈1型糖尿病，尤其是對于早期發病的年輕患者，現有治療方法未能明顯降低20～44歲患者的死亡率[3-4]。因此，迫切需要尋找新的治療方法以降低患者的死亡率和并發癥發生率，提高患者生活質量。在各種新的治療方法中，干細胞療法是一種能恢復正常胰島功能并取代外源性胰島素治療的新療法。干細胞療法治療1型糖尿病歷經數十年的發展，在實驗室水平和臨床研究中均取得了一定的進展并有患者從中獲益。現從1型糖尿病的發病機制、主流干細胞療法的研究方向、實驗室水平以及臨床試驗結果等方面介紹干細胞療法治療1型糖尿病的新進展。

1 1型糖尿病的發病機制

1型糖尿病的發病過程為自身免疫抗體和免疫細胞異常攻擊胰島β細胞，導致胰島β細胞減少或失去功能，包括分泌胰島素和感知血糖水平變化等功能出現缺損或缺失，最終導致血糖異常升高。具體來說，機體免疫系統無法正確識別胰島細胞表面的自身抗原或將胰島β細胞識別為異常組織，其表面或分泌的抗原被樹突狀細胞或巨噬細胞呈遞給CD4+T細胞或CD8+T細胞，CD4+T細胞激活B細胞的增殖分化，并釋放特異性抗體攻擊胰島β細胞。特異性抗體識別的胰島β細胞的靶點主要是胰島素和谷氨酸脫羧酶6，針對這兩種靶點的抗體出現的時間通常<2周歲，此后針對酪氨酸磷酸酶樣分子IA-2或鋅離子轉運蛋白8的自身抗體可出現上調，但其產生的具體機制和作用尚待明確[5]。除自身免疫抗體外，被激活的CD8+細胞毒T細胞也可直接損傷β細胞或與自身免疫抗體共同作用導致細胞損傷，但其造成損傷的程度可能在不同患者中表現不一[6]。

1型糖尿病發生發展的過程離不開遺傳和環境因素的共同作用。遺傳因素包括第6號染色體上編碼人類白細胞抗原(human leucocyte antigen，HLA)2類分子基因的單倍型HLA-DR3-DQ2、HLA-DR4-DQ8和編碼胰島素基因，這兩類基因主要調控免疫系統(產生自身免疫抗體、改變免疫細胞反應活性)和分泌胰島素[7]。研究發現，與上述兩類基因不相關的基因也可能與1型糖尿病的患病風險相關[5]。

影響1型糖尿病的環境因素貫穿產前產后兩個時期。妊娠期環境因素主要包括先天性麻風、孕產婦腸道病毒感染、剖宮產、胎兒體重超標、產婦高齡以及蔬菜攝取過低等；針對新生兒的環境因素包括腸道病毒感染，頻繁換氣，腸道菌群異常，過早接觸谷物、雞蛋、牛奶和根莖類蔬菜，超重以及各種嚴重的新生兒疾病[5,8]；新生兒期后，嬰幼兒持續或反復的腸道感染、超重或體重增長過快、高血糖負荷或果糖攝入過多、食物中硝酸鹽和亞硝酸銨過量、接受糖皮質激素療法，甚至青春期激素水平變化以及精神壓力過大亦可影響1型糖尿病進展[8]。

以上遺傳和環境因素共同作用，最終在胰島組織內形成了由自身免疫反應引發的炎性病灶，破壞胰島β細胞，使患者喪失正常的產胰島素功能。而干細胞療法正是從1型糖尿病的發病機制出發，從內分泌細胞和免疫細胞兩個方面，試圖恢復患者正常的產胰島素功能，改變患者異常的自身免疫狀態，繼而從根本上治愈1型糖尿病。

2 干細胞療法治療1型糖尿病在實驗室水平的研究進展

目前在實驗室水平上用于1型糖尿病治療的干細胞有胚胎干細胞、誘導性多能干細胞(induced pluripotent stem cell,iPSCs)、間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)、骨髓來源的造血干細胞(hematopoietic stem cell,HSCs)以及胰腺內的多能前體細胞、前體細胞以及存在于胰腺外(脾臟、肝臟、子宮內膜)的β細胞前體細胞。干細胞治療1型糖尿病是基于干細胞的自我更新功能和潛在的定向分化功能，相較于完全異體胰腺組織移植，移植前能夠在分子水平進行嚴格的質量控制，并能對移植細胞質量和免疫排斥反應進行有效評估，因而干細胞療法可以部分或完全避免免疫排斥反應所導致的移植失敗和移植術后并發癥。

目前1型糖尿病的干細胞療法除少部分進入臨床試驗外，大部分研究還處于細胞和動物實驗水平。在實驗室水平利用iPSCs、MSCs、HSCs和胰腺外細胞治療1型糖尿病的研究已在不同程度上取得了進展，其結果也成為行臨床試驗的證據和保障。利用胚胎干細胞治療1型糖尿病雖然在理論上可行，但成功率低以及倫理學上的問題影響了研究進展，故不予詳細介紹。

2.1iPSCs療法 iPSCs治療1型糖尿病屬于再生醫學范疇，其基本原理是將體細胞逆轉為早期未分化的多能干細胞，再經各種細胞因子處理以模仿胚胎細胞的生長發育過程，誘導其成為具有分泌胰島素功能的胰島β細胞。與胚胎干細胞不同，iPSCs只能形成新的組織和器官，而不能形成新的個體，所以能夠避免潛在醫學倫理問題，且因細胞來源于患者本身，所以還可減少或完全避免免疫排斥反應。

IPSCs療法治療1型糖尿病的操作流程為：首先通過過表達聚體結合轉錄因子3/4、性別決定區盒2因子、Krüpple樣因子4以及c-Myc四種轉錄因子將體細胞轉化成具有多種分化能力并能夠自我更新的原始干細胞[9-10]，然后利用化學藥物或純化的細胞因子調節各種多能干細胞的生存通路和分化通路，包括節點激活素信號通路、Wnt通路、視黃酸信號通路、Hedgehog信號通路、成纖維細胞生長因子通路、表皮生長因子通路、骨形態發生蛋白通路以及Notch信號通路等。在各種信號通路的影響下，多能干細胞從最初的原始狀態逐步分化成為內胚層細胞、原始腸管細胞、后前腸細胞、胰腺內胚層細胞、內分泌前體細胞，最后分化成為胰島β細胞[11]。以上過程需要在體外對細胞進行誘導分化，并根據不同分化階段細胞的表面細胞標志物鑒定、篩選以及純化分化后的克隆株，避免在任何分化步驟中出現非目標細胞而導致分化效率降低，或因不受控制的增殖造成嚴重的不良反應，移植后患者還需接受嚴格的評估以判斷移植是否成功以及有無嚴重的不良反應，如非胰島β細胞異常增殖所形成的腫瘤，或胰高血糖素、生長抑素等非胰島素激素的異常升高等。

由于iPSCs療法體外誘導過程復雜，目前利用iPSCs治療1型糖尿病仍停留在實驗室階段。Pellegrini等[12]利用人類來源的iPSCs在體外誘導分化成為胰島β細胞，隨后將其移植到小鼠體內，結果發現，移植的細胞對體內葡萄糖水平有反應。來自中國和日本的課題組成功地從iPSCs誘導出具有胰島素分泌功能、可感受人體血糖水平并進行反應的細胞，且移植后可在短期內維持小鼠的正常血糖水平[13-14]。由于iPSCs強大的分化能力，即使非常嚴格控制細胞的分化類型，移植分化終末端的細胞可能還會出現不受控制的增殖并形成腫瘤，也可能產生胃泌素或生長抑素等其他胰島細胞相關激素[10]。若出現這些不良反應，相較于傳統療法，iPSCs療法的弊端可能大于治療本身獲益，故對于iPSCs治療1型糖尿病還需要更深入的臨床前研究以增加其安全性和可靠性。

2.2MSCs療法 MSCs存在于骨髓、臍帶以及脂肪組織中，與iPSCs相比，MSCs雖然具有一定的定向分化功能，但并不能形成一個完整的器官。普通未經誘導處理的MSCs一般可以分化為成軟骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、肌細胞以及神經細胞，對MSCs進行一定的基因修飾后，其也可以分化為具有分泌胰島素功能的細胞。MSCs相對局限的分化能力能夠避免iPSCs療法移植細胞出現非胰島β細胞的異常增殖分化。

已有研究表明，人類骨髓來源的MSCs經過體培養或通過病毒轉染轉錄因子基因胰島素啟動因子1、HLXB9和叉頭框轉錄因子A2可轉化為具有胰島β細胞特征和功能的細胞[15-16]。Tang等[16]發現，移植由MSCs誘導的β細胞可逆轉糖尿病小鼠的高血糖血癥。除骨髓來源的MSCs,脂肪來源的MSCs因獲取容易，成為治療1型糖尿病的新希望。近年來多項基于小鼠模型的研究發現，脂肪來源的MSCs經誘導后可成為產胰島素細胞，并可在小鼠模型中正常分泌胰島素[17-23]。

除分化成類胰島細胞外，MSCs還具有免疫調節功能。MSCs在免疫微環境中可以分化成兩種表型，一種是促進炎癥的MSC1，另一種是抑制炎癥的MSC2。MSC表型的轉化和分化依賴于免疫微環境狀態，在促炎免疫微環境中，MSCs會釋放吲哚胺2,3-雙加氧酶、一氧化氮、前列腺素E2、轉化生長因子-β等細胞因子，抑制T細胞增殖。MSCs對免疫微環境中的各種T細胞亞型有著廣泛影響，正常生理條件下，胰腺組織中的輔助性T細胞(helper T cell,Th細胞)、調節T細胞以及細胞毒T細胞相互協調；但在1型糖尿病的病理狀態下，各種T細胞亞型的數量和功能發生異常[24]。Li等[25]研究發現，移植MSCs后Th1與Th2細胞的比例降低，原始T細胞更多地分化成Th2細胞，從而抑制炎癥反應。此外，移植MSCs也可抑制具有促進1型糖尿病炎癥發展的Th17細胞，并抑制抗胰島β細胞的細胞毒性T細胞功能，并且MSCs可以提高調節T細胞在體內的分化增殖，從而達到抑制Th1和Th17細胞的作用。總之，MSCs移植可以干擾具有促炎癥作用的效應T細胞，抑制自身免疫反應[26]。以上是MSCs調控針對胰島β細胞自身免疫炎癥微環境的理論基礎。

MSCs的免疫調節功能在多種來源的細胞中均存在，如臍帶血來源的MSCs在體外培養可恢復T細胞等免疫細胞的免疫調節功能[27-28]；Fiorina等[29]研究發現，BALB/c-MSC小鼠中MSCs表面的程序性細胞死亡配體-1和血液中Th2細胞上調，提示脂肪來源的MSCs可能會抑制1型糖尿病患者的自身免疫失調。MSCs來源較廣，且兼具免疫調節和分化成產胰島細胞的功能。

2.3自體造血干細胞療法 CD34陽性(CD34+)HSCs是一種能夠自我更新并分化為所有造血系細胞的干細胞，與MSCs不同,自體HSCs移植的目的是改變患者異常的免疫系統狀態，產生新的免疫細胞，替代針對胰島β細胞產生抗體的B細胞或針對胰島β細胞的T細胞和抗原呈遞細胞，改善免疫系統環境，使新生或暫時喪失功能的胰島β細胞得以生存和增殖。

研究發現，移植前對受體小鼠進行放療清除骨髓原有細胞后再進行移植，來自供體的骨髓干細胞在受體內存活，替代被清除的異常免疫細胞，使胰島β細胞存活，并最終使小鼠血糖正常化[30]；也有研究發現，注射骨髓來源的干細胞或者純化后的HSCs后，在受體小鼠體內發現由供體干細胞直接分化成的胰島素陽性細胞，提示HSCs不僅具有免疫調節功能，還具有分化功能[31]。因人類HSCs與小鼠HSCs在生物學特征和功能上有明顯區別(如小鼠HSCs CD34的表達水平較低，而人類CD34的表達水平較高)，移植人類HSCs后小鼠血糖正常化率沒有直接在人體進行干細胞移植高，除在小鼠中獲得成功外，其余實驗或是沒有得到移植有效的結果，或是發現HSCs移植只能夠改善小鼠的免疫環境并預防1型糖尿病，但對于已患有1型糖尿病的小鼠，單純注射HSCs并不能逆轉疾病[32]。綜上，對于HSCs療法的實驗室模型和實驗條件的選擇還有待進一步研究探索，這對于如何篩選適合HSCs療法的患者、優化治療操作流程、提高治療成功率有重要作用。

2.4利用其他胰腺外細胞治療1型糖尿病 除利用iPSCs、MSCs和HSCs等具有自我更新和分化能力的干細胞外，還可利用已經分化完成的細胞(如肝細胞、脾臟上皮細胞)直接移植或在體外進行基因編輯后再移植。如通過基因編輯技術使肝細胞表達Pdx-1、β胞素和神經D素后，肝細胞可轉化成表達胰島β細胞標志物的新細胞，并能分泌胰島素[33-34]。有報道稱，給糖尿病NOD小鼠移植成人的脾臟細胞能夠實現血糖的正常化，并在小鼠體內發現了正常的胰島組織[35]。但此研究結果并未在其他相似的研究中得到重復。有研究認為，小鼠體內恢復的胰島組織實際上是宿主小鼠本身殘留的β細胞[36]。對于脾臟細胞在1型糖尿病中的作用還有待進一步研究。

3 干細胞療法治療1型糖尿病在臨床水平的研究進展

近年來，干細胞療法已被廣泛用于白血病、腦損傷、晚期肝硬化等疾病和自身免疫疾病的治療。對于同樣具有自身免疫疾病病理基礎的1型糖尿病，干細胞療法已在細胞和動物實驗中取得了可靠的陽性結果，有關臨床試驗也在全球范圍內逐步開展。目前www.clinicaltrials.gov網站可以檢測到的關于1型糖尿病干細胞療法的相關臨床研究已有53項，其中完成的且介入方式為干細胞移植的有7項(表1)，以HSCs和MSCs療法為主。

治療1型糖尿病前，HSCs療法已被用于諸多自身免疫疾病的治療，這些治療案例為HSCs療法應用于1型糖尿病提供了治療規范流程和經驗。與動物實驗一樣，HSCs療法的臨床試驗也未取得較為一致的陽性結果，但在人體中干細胞移植成功后的有效率卻較動物實驗高，這也體現了現有的小鼠模型并不一定適合HSCs療法的臨床前研究。有研究通過對23例1型糖尿病患者進行前瞻性研究發現，接受自體非清髓性HSCs移植后，經7～58個月的隨訪，有20例患者長期或暫時性脫離外源性胰島素治療，其中8例復發，2例在使用西他列汀治療后再次脫離了外源性胰島素治療，隨訪周期內所有患者均未發生糖尿病相關的嚴重并發癥[37]。清髓性HSCs移植療法能夠完全或部分解除患者對外源性胰島素的依賴，恢復患者體內的免疫細胞和細胞因子水平，且未發生嚴重的并發癥[38]。由于HSCs療法開展的時間較晚，治療流程還未較好優化，所以并發癥也較常見。雖然HSCs療法有發生并發癥的風險，但在移植過程中使用輕度到中度的免疫抑制方案，如環磷酰胺(總量2.0 g/m2)和氟達拉濱(總量120 mg/m2)能夠有效避免重度并發癥的發生，有效延長外源胰島素非依賴狀態的時間[41]。在一些HSCs移植失敗的臨床試驗中并發癥更為嚴重，如發熱性中性粒細胞減少癥、惡心、脫發，誘發自身免疫疾病，甚至嚴重的全身性感染，也有因移植造成的嚴重并發癥而死亡的報道[42]。因此，除提高HSCs療法的有效性外，提高療法的安全性也是重要的研究課題。

表1 干細胞治療1型糖尿病已完成的臨床試驗歸納表

HSCs成功移植后也有可能對血糖調節無效。Malmegrim等[43]認為，HSCs療法的成功與否可能與患者的自身免疫狀態有關。該研究發現，在HLA-A2陽性患者中，細胞毒性T細胞高反應患者在移植后24個月內因血糖控制不佳，需要重新使用胰島素替代療法治療，而細胞毒性T細胞低反應患者血糖全部控制良好，無需額外補充外源性胰島素[43]。此外，在其他臨床試驗中也有證據表明血清內炎癥因子的水平與患者預后相關，如血清白細胞介素-10、白細胞介素-4、轉化生長因子-β、移植后禁食時C肽水平與HSCs移植效率呈正相關，而血清腫瘤壞死因子-α水平及移植前胰島素的使用量與移植成功率呈負相關[44]。因此，在HSCs移植前對患者免疫狀態進行謹慎評估對移植術預后可能有重要影響。

相對于HSCs，目前MSCs療法已完成的針對1型糖尿病患者的臨床試驗較少。Carlsson等[39]將1型糖尿病患者分為移植組和對照組發現，70%移植 MSCs的患者經過12個月的觀察后，C肽釋放試驗應出現的峰值得以恢復，C肽的整體水平亦明顯高于對照組，提示移植組患者的胰島功能保留或明顯恢復，且隨訪過程中未出現嚴重并發癥。目前大部分注冊的MSCs療法的臨床試驗正處于進行和募集患者階段。

以上已經完成的臨床試驗提示干細胞治療1型糖尿病，尤其是HSCs療法，可在短期和中期內為部分患者提供較好的治療效果。隨著更多以及更大隊列研究的開展，干細胞治療1型糖尿病的臨床效果會被進一步展示，更成熟規范的治療方案也會相繼出現，從而提高患者的生存質量，減少并發癥的發生。

4 小 結

由于胰島素替代療法的局限性，1型糖尿病患者尤其是年輕患者急需新的治療手段以減少并發癥的發生，降低死亡率，并提高患者生活質量。近年來，干細胞移植治療1型糖尿病在基礎和臨床研究中均取得了一定的進展，雖然目前還無法替代外源性胰島素的作用，但逐漸增多的體外和體內研究為干細胞療法的實際應用提供了可能，尤其是利用MSCs和HSCs治療1型糖尿病取得了一定的進展。目前參與治療的患者人數較為局限，且沒有統一的治療程序和標準，但隨著更多臨床試驗的開展，其研究結果將引導科研和醫務工作者對此療法進行更加深入的評估和思考。