碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌的耐藥機制及其與Ⅰ類整合子的相關性研究

楊雪嬌，楊歡，焦芳艷,2a，尹鐵球,2b

(1.湖南中醫藥大學臨床醫學院，長沙 410007；2.湖南省腦科醫院 a.臨檢中心，b.檢驗科，長沙 410007)

銅綠假單胞菌是一種常見的機會致病菌，是引起免疫力低下患者細菌感染的常見病原體，由于碳青霉烯類抗菌藥物的臨床廣泛使用，該類藥物耐藥株不斷增加，導致銅綠假單胞菌感染易反復發作，且難以控制[1-2]。銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物發生耐藥的原因多樣，產碳青霉烯酶是最常見的原因之一[3]。酶基因易被可移動元件攜帶，進而造成耐藥因子的播散。

近年來，越來越多的研究發現，整合子在介導銅綠假單胞菌從單一耐藥向多重耐藥轉變過程中發揮了重要作用[4-6]。整合子是一種可移動遺傳元件，存在于細菌染色體或質粒中，可以捕獲多種耐藥基因，使細菌耐藥性在同種細菌或異種菌屬間發生水平轉移，使細菌具有多重耐藥性[7-10]。在目前已經發現的6種類型耐藥整合子中，由于Ⅰ類整合子攜帶耐藥基因盒種類多、宿主廣泛，故成為引起細菌間耐藥性播散的重要原因之一[11-12]。故本研究以亞胺培南/美羅培南耐藥的銅綠假單胞菌為研究對象，依據美國臨床和實驗室標準協會(Clinical Laboratory Standards Institute，CLSI)標準檢測碳青霉烯酶，探討銅綠假單胞菌與Ⅰ類整合子的相關性，現報道如下。

1 資料與方法

1.1菌株來源及鑒定 選取2018年10月至2019年2月湖南省腦科醫院臨床分離的110株非重復銅綠假單胞菌。入組菌株經全自動細菌鑒定儀鑒定，根據CLSI 2018版標準[13]中亞胺培南或美羅培南的最低抑菌濃度判斷藥敏檢測結果，其中最低抑菌濃度≥8 μg/mL，判定為碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌(Carbapene-resistant pseudomonas aeruginosa，CRPA)；最低抑菌濃度≤2 μg/mL，判定為碳青霉烯類敏感銅綠假單胞菌。質控菌株為標準菌株ATCC 27853和ATCC 25922，均選自衛生部門臨床檢驗中心。

1.2儀器與試劑 實驗儀器包括全自動細菌鑒定儀(法國梅里埃公司，型號：VITEK-2 compact)；JUNYI電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司，型號：JY600C)；凝膠成像儀(美國柯達公司，型號：Gel Logic 212)；超微量分光光度計(美國賽默飛世爾科技有限公司，型號：NanoDrop Lite)。試劑包括美羅培南藥敏紙片(英國Oxoid公司，批號：2408075)；細菌DNA提取試劑盒(美國Omega公司，批號：00D3350010000G20R079)；Premix Ex Taq試劑盒(日本TaKaRa公司，批號：AI51239A)；100 bp DNA Ladder(北京Solarbio公司)；引物由上海生工及湖南擎科公司合成。

1.3方法

1.3.1碳青霉烯酶的檢測 ①改良Hodge法：依據2017年CLSI標準[14]，首先調制0.5麥氏濁度大腸埃希菌ATCC 25922的菌懸液，按1∶10稀釋；然后按照紙片擴散法步驟將稀釋后菌液涂布于MH平板上，干燥3～10 min后貼美羅培南紙片，最后將待測菌垂直于藥敏紙片，從紙片邊緣向平板邊緣劃線(20～25 mm)，在35 ℃條件下孵育16～20 h。結果判讀標準為待測菌在抑菌圈內呈現矢狀生長者為陽性。②改良碳青霉烯滅活法(modified carbapenem inactivation method，mCIM)：依據2019年CLSI標準[15]，用10 μL接種環將滿環過夜生長待測菌落接種于2 mL胰蛋白胨大豆肉湯中，充分渦旋振蕩10～15 s后，向每支試管中加入一片含10 μg美羅培南的無菌紙片，在35 ℃條件下孵育4 h。孵育即將結束時，立即調制0.5麥氏濁度ATCC 25922菌懸液，菌懸液制備后必須在15 min內涂布于MH平板上，干燥3～10 min；將美羅培南紙片從胰蛋白胨大豆肉湯中取出，控干多余液體后貼在已涂布ATCC 25922的MH平板上，隨后在35 ℃條件下孵育18～24 h。結果判讀標準如下。a.碳青霉烯酶陽性：沒有抑菌圈或抑菌圈直徑6～15 mm，或抑菌圈直徑16～18 mm，但抑菌圈內有散在菌落；b.碳青霉烯酶陰性：抑菌圈直徑≥19 mm；c.碳青霉烯酶中性：抑菌圈直徑為16～18 mm，或抑菌圈直徑≥19 mm，但抑菌圈內有散在菌落，無法判定是否產生碳青霉烯酶。

1.3.2Ⅰ類整合子的檢測 采用聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)技術檢測 Ⅰ 類整合子。①制備DNA模板。參考提取細菌DNA試劑說明書提取細菌DNA，使用超微量分光光度計檢測模板純度，A260/A280在1.7～1.9，于-20 ℃冰箱中保存備用。②擴增整合酶基因。PCR反應體系為25 μL，Premix Ex Taq 12.5 μL，模板DNA 0.7 μL，上下游引物各0.8 μL(引物序列見表1[16])，RNase Free ddH2O 10.2 μL；配置反應體系在冰上進行，以減少核酸降解。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，52.5 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環，72 ℃延伸10 min。擴增后產物經1.5%瓊脂糖凝膠在100 V恒壓下電泳30 min，經凝膠成像儀掃描后觀察結果。

表1 Ⅰ類整合子及可變區引物序列[16]

1.3.3可變區的檢測 可變區PCR反應體系為25 μL：Premix Ex Taq 12.5 μL，上述Ⅰ類整合子陽性菌株的基因組DNA為模板DNA 0.7 μL，上下游引物各0.8 μL，RNase Free ddH2O 10.2 μL；配置反應體系在冰上進行，以減少核酸降解。反應條件：95 ℃預變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環，72 ℃延伸10 min。擴增后產物經1.5%瓊脂糖凝膠在100 V恒壓下電泳50 min，經凝膠成像儀掃描后觀察結果。

1.4統計學方法 采用SPSS 22.0統計軟件進行數據處理，計數資料比較采用χ2檢驗，相關性計算列聯系數，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1碳青霉烯酶檢測結果 110株臨床分離的銅綠假單胞菌中，經VITEK-2 compact細菌鑒定儀以及藥敏試驗檢出CRPA 39株，其中15.38%(6/39)表現為mCIM法和改良Hodge試驗同步陽性，僅1株表現為mCIM法陽性，部分實驗結果見圖1。

2.2Ⅰ類整合子檢測結果 Ⅰ類整合子檢出率為19.09%(21/110)，其中碳青霉烯類敏感株Ⅰ類整合子的檢出率為9.86%(7/71)，耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌Ⅰ類整合子的檢出率為35.90%(14/39)，差異有統計學意義(χ2=11.049，P=0.002)，見表2。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳Ⅰ類整合子的擴增產物為457 bp左右，與目的條帶大小一致，見圖2。

2.3PCR檢測可變區 以檢出的21株Ⅰ類整合子陽性菌株基因組DNA為模板擴增可變區，結果顯示，57.14%(12/21)可變區成功擴增，可變區片段長度為800～4 500 bp，大小不等，見圖3，其中碳青霉烯類敏感株可變區檢出率為2.82%(2/71)，而碳青霉烯類耐藥株可變區檢出率為25.64%(10/39)，差異有統計學意義(χ2=13.493，P<0.01)。

mCIM：改良碳青霉烯滅活法；CRPA：耐碳青霉烯類銅綠假單胞菌；2、6、8、16、18、20為菌株編號，其中2、16為mCIM法和改良Hodge試驗陽性

表2 Ⅰ類整合子在碳青霉烯耐藥組與碳青霉烯敏感組中的分布差異 (株)

PCR：聚合酶鏈反應；M：標志物Marker；-：陰性對照；+：陽性對照；2、16、20、23為菌株編號

PCR：聚合酶鏈反應；M：標志物Marker；-：陰性對照；20、23、41、56、67、71、81、87、88、90、93、115、273、283為可變區陽性株

2.4Ⅰ類整合子與碳青霉烯酶的關系 在39株CRPA中，7株檢出碳青霉烯酶銅綠假單胞菌，且均攜帶Ⅰ類整合子，碳青霉烯耐藥銅綠假單胞菌產碳青霉烯酶與Ⅰ類整合子的攜帶具有一定相關性(r=0.530，P<0.01)，見表3。

表3 39株CRPA中Ⅰ類整合子與產碳青霉烯酶菌株的分布情況 (株)

3 討 論

銅綠假單胞菌是醫院感染的主要病原菌之一，常引起皮膚黏膜、呼吸道、泌尿道等感染。碳青霉烯類藥物是臨床治療銅綠假單胞菌感染的常用抗菌藥物，具有抗菌譜廣、抗菌活性強的特點[17]，但隨著碳青霉烯類藥物的廣泛應用，銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物的敏感性不斷下降。據2017年全國細菌耐藥監測網統計，在革蘭陰性菌分離榜中，銅綠假單胞菌感染居第三位，其對碳青霉烯類藥物的耐藥率平均為20.7%[18]。本研究中，CRPA的檢出率為35.45%，提示湖南省腦科醫院銅綠假單胞菌的感染形勢依然嚴峻，故需嚴密監測和減少銅綠假單胞菌感染，以避免銅綠假單胞菌的院內大規模感染。因此，探討不同地區CRPA耐藥性及整合子耐藥基因的表達，并分析其耐藥機制，以指導臨床科學用藥和控制院內感染[19-21]。CRPA的耐藥機制主要包括產生碳青霉烯酶、孔蛋白突變、MexA-MexB-OprM外排泵超表達等，其中碳青霉烯酶的產生是CRPA耐藥的重要原因之一[22-23]。本研究結果顯示，17.95%(7/39)臨床分離的CRPA為產碳青霉烯酶，說明碳青霉烯酶是導致湖南省腦科醫院銅綠假單胞菌對碳青霉烯類藥物耐藥的原因之一。

銅綠假單胞菌的耐藥機制復雜，整合子作為一種可移動的遺傳元件，是介導細菌耐藥的重要因素之一。有研究顯示，與未攜帶Ⅰ類整合子菌株相比，攜帶Ⅰ類整合子菌株對多數抗生素的耐藥率較高，提示Ⅰ類整合子在銅綠假單胞菌耐藥形成中發揮著重要作用[24]。本研究中，Ⅰ類整合子在碳青霉烯類敏感株與碳青霉烯類耐藥株的分布差異有統計學意義，Ⅰ類整合子的檢出率為19.09%(21/110)，與上述文獻報道趨勢一致。此外，本研究中，7株產碳青霉烯酶的銅綠假單胞菌均攜帶了Ⅰ類整合子，CRPA產碳青霉烯酶與Ⅰ類整合子的攜帶具有一定相關性(P<0.01)，提示湖南省腦科醫院銅綠假單胞菌碳青霉烯類耐藥可能與Ⅰ類整合子攜帶相關耐藥基因盒密切相關；有57.14%(12/21)的Ⅰ類整合子陽性菌株成功擴出可變區，且可變區片段均較大，多在3 000～5 000 bp附近，提示Ⅰ類整合子整合的耐藥基因較多，可能攜帶除碳青霉烯酶以外的其他類型耐藥基因盒，從而加速細菌耐藥性的播散及流行；其中，93號菌株存在兩條獨立條帶，可能攜帶了不同類型的整合子或不同的耐藥基因盒。

本研究結果顯示，Ⅰ類整合子和碳青霉烯酶的攜帶在銅綠假單胞菌對碳青霉烯酶類耐藥甚至多重耐藥中發揮了重要作用，兩者具有中度一致性。但本研究樣本量較小，仍需進行大樣本量各類整合子分析，通過基因測序技術分析可變區相關耐藥基因盒的攜帶情況，從而進一步明確銅綠假單胞菌的耐藥性機制。

綜上所述，研究期間湖南省腦科醫院銅綠假單胞菌對碳青霉烯類耐藥可能與Ⅰ類整合子攜帶相關耐藥基因有關。應繼續嚴格實施抗生素管理制度、加強院內感染監測，進一步完善整合子的相關研究。