白芍總苷膠囊對4-VO誘導的MCAO大鼠的神經保護作用及其機制探究

陳恒石，蔣磊

(安徽省第二人民醫院藥學部，合肥 230041)

大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)損傷是導致缺血性腦血管病患者死亡的最主要因素之一[1]。MCAO損傷機制與一氧化氮(nitric oxide，NO)等自由基生成、細胞內Ca2+超載、興奮性氨基酸毒性、炎癥反應、胱天蛋白酶(caspase)-3活化等有關，上述機制相互作用導致腦細胞凋亡或壞死。目前，MCAO治療以西藥為主，但效果欠佳，研究發現，中草藥治療MCAO具有高效、低毒、價廉等特點，成為近年來的研究熱點[2]。顏娟等[3]研究發現，牡荊苷可通過提高MCAO小鼠腦組織ATP、腺苷二磷酸、腺苷一磷酸水平及計算能荷(EC)值，改善腦組織能量代謝，降低MCAO小鼠的腦組織損傷。李敏等[4]和曹利華等[5]研究也發現，毛冬青總皂苷通過降低MCAO小鼠腦組織中NO水平和一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活力，改善MCAO誘導的神經細胞損傷。白芍總苷(total glucosides of paeong，TGP)具有抗炎、抗氧化等作用[6-7]，可通過抑制氧化應激和炎癥反應、改善血液流變學指標等途徑保護MCAO對神經系統的損傷[8-9]，但有關TGP對MCAO腦保護作用的具體機制尚不明確。本研究擬在TGP治療MCAO大鼠具有確切療效的基礎上，考察其對大鼠腦組織中Toll樣受體(Toll-like receptor，TLR)4水平的影響，并對磷酸化c-Jun氨基端激酶(phosphorylated c-Jun N-terminal kinase，p-JNK)、磷酸化胞外信號調節激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated kinase，p-ERK)、p-p38、核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)、caspase-3等TLR4通路相關信號分子水平進行檢測，以期獲得TGP治療MCAO的部分可能機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 選取40只6～8周齡健康雄性SD大鼠(成都達碩生物科技有限公司，生產許可證號：SCXK(川)2018-24)，體重200～250 g，適應性飼養1周，期間給予自由飲水和飲食，光照白晝各12 h。

1.1.2實驗試劑和儀器 ①4%多聚甲醛(上海遠慕生物科技有限公司生產，批號：YM-MY803J；規格：250 mL/瓶)。②丙二醛(malondialdehyde，MDA)、活性氧類(reactive oxygen species，ROS)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、NO、NOS等酶聯免疫吸附測定法試劑盒(武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司生產，貨號分別為E-EL-0060c、E-EL-0022c、E-EL-R0355c、E-EL-0047c、E-EL-R0013c；規格均為96T)。③原位末端轉移酶標記技術(TdT-mediated dUTP nick-end labeling，TUNEL)試劑盒(美國Chondrex生產，貨號：4009；規格：25 mg/mL×5 mL)。④抗TLR4(單克隆兔抗)、抗p-JNK(單克隆鼠抗)、抗p-ERK(單克隆兔抗)、抗p-p38抗體(單克隆兔抗)、抗NF-κB(單克隆兔抗)、抗caspase-3(單克隆兔抗)(美國Cell Signaling Technology生產，貨號分別為：14358S、9255S、43966S、14472S、8480S、13667S；規格均為100 μL)。⑤免疫組織化學試劑盒(北京博奧龍免疫技術有限公司，貨號：BF06099；規格：500片)。⑥H1650-W離心機、TGL-20M高速臺式冷凍離心機(湖南湘儀實驗室儀器有限公司)；CKX41倒置顯微鏡、IX-71熒光倒置顯微鏡(日本Olympus光學工業株式會社)；Infinite M1000 Pro全波長酶標儀(美國TECAN公司)；TANKPE060高純水機(美國Millipore公司)。

1.2實驗方法

1.2.1分組和模型建立 80只SD大鼠經適應性飼養1周后，稱取體重，根據體重分層隨機分為對照組、TGP組、Pulsinelli四血管(4-vessle occlusion,4-VO)模型組、4-VO+TGP組，每組20只。4-VO模型組大鼠行全身麻醉后，參照4-VO阻斷法建立MCAO大鼠模型，夾閉血管20 min后，去除止血夾，恢復血流灌注；對照組和TGP組不夾閉血管。造模成功標準[10]：①腦電圖波幅下降至基礎波幅的1/4以下；②翻正反射消失；③瞳孔顏色變灰白。

1.2.2實驗治療 將TGP膠囊內顆粒與適量0.9%氯化鈉溶液混合，制備成100 mg/mL的TGP溶液。TGP組和4-VO+TGP組使用TGP溶液灌胃給藥(200 mg/kg)；對照組和4-VO模型組給予等體積(2 mL/kg)0.9%氯化鈉溶液，每周6次，療程14 d。

1.2.3腦含水量測定 水合氯醛麻醉，采用斷頭法處死大鼠，取出完整腦組織，稱重(記為濕重W)，110 ℃烤箱內烘烤48 h，稱干重(D)，計算腦含水量[(W-D)/W×100%]。

1.2.4蘇木精-伊紅染色 每組將6只大鼠腦組織標本放置于4%甲醛溶液中充分浸泡30～50 min固定，隨后嚴格按照蘇木精-伊紅染色方法進行操作。

1.2.5酶聯免疫吸附測定法 給藥完畢后，取股動脈血致大鼠死亡，血液靜置30 min后，在4 ℃條件下，以離心半徑10 cm，2 000 r/min離心20 min，取上清液保存備用。檢測MDA、ROS和SOD、NO、NOS水平，嚴格按照試劑盒說明書要求進行操作。

1.2.6蛋白印跡法(Western blot) 采用蛋白印跡法檢測TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3蛋白表達。①將加入細胞裂解液的烘干后大鼠腦組織立即在冰上進行研磨，持續30 min，隨后將混合液置入離心管中。②將離心管置于低溫高速離心機內，在4 ℃條件下，以離心半徑6 cm，11 000 r/min離心15 min，取上清液。③采用BCA法定量檢測蛋白水平，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳蛋白緩沖液(3∶1)，持續沸水浴5 min后，-20 ℃條件下儲存備用。④在110 mV電壓下，采用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白質，溴酚藍區帶到達分離膠以后，電壓調至200 mV，持續2 h，溴酚藍區帶進入分離膠末端，并即將泳出分離膠底部，轉至硝酸纖維膜上。⑤將脫脂奶粉與含10%吐溫磷酸鹽緩沖液溶液按照20∶1的比例混勻，室溫條件下封閉1 h；依照一抗的推薦濃度和用量進行稀釋。在4 ℃條件下，孵育8 h。⑥將已標記辣根過氧化物酶二抗(抗兔IgG抗體，1∶2 000稀釋)工作液封口，在37 ℃條件下，孵育1 h。⑦采用凝膠成像分析儀掃描并分析結果。繪制標準曲線，并計算濃度，結果用相對灰度值表示。

1.2.7腦梗死范圍的測定 將標題1.2.3中獲得的腦組織在-20 ℃條件下速凍15 min，按照冠狀位方向切成5份，隨后置于2%的2,3,5-氯化三苯基四唑氮溶液，在37 ℃條件下孵育30 min，正常腦組織染為紅色(R)，梗死灶染成白色(W)，4%多聚甲醛液固定24 h，拍照。計算腦梗死體積[W/(W+R)×100%]。

1.2.8腦組織中TLR4的表達檢測 將大鼠腦組織切片，在60 ℃烘箱中烘干，隨后進行免疫組織化學操作，嚴格按照免疫組織化學試劑盒操作步驟操作。

2 結 果

2.14-VO模型組大鼠一般情況觀察 4-VO模型組大鼠造模后，首先出現興奮、易激惹等表現，繼而出現步態不穩，四肢癱軟無力，呼吸急促、抽搐、昏睡等癥狀，可伴有小便失禁。3～4 d后，大鼠精神差，進食減少，出現稀便和不同程度的嗜睡，皮毛無光澤，活動量減少，體重增加緩慢。整個造模期間，大鼠均未出現死亡。

2.2四組大鼠腦梗死體積、腦含水量比較 與對照組相比，4-VO模型組大鼠腦梗死體積和腦含水量均明顯增加(P<0.01)；與4-VO模型組相比，4-VO+TGP組大鼠腦梗死體積和腦含水量明顯降低(P<0.01)；TGP組與對照組腦梗死體積和腦含水量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.3TGP對MCAO大鼠MDA、ROS、SOD、NO、NOS水平的影響 四組大鼠MDA、ROS、SOD、NO、NOS水平比較差異有統計學意義(P<0.05)，與對照組相比，4-VO模型組大鼠血清MDA、ROS、NO和NOS水平均明顯升高，SOD水平明顯降低(P<0.05)；而與4-VO模型組相比，4-VO+TGP組MDA、ROS、NO和NOS水平均明顯降低，SOD水平明顯升高(P<0.05)；對照組和TGP組MDA、ROS、NO、NOS、SOD水平比較差異無統計學意義(P>0.05)；與TGP組相比，4-VO+TGP組NO、NOS水平明顯升高，SOD水平明顯降低(P<0.05)。見表2。

表1 四組大鼠腦梗死體積、腦含水量比較

2.4四組腦組織蘇木精-伊紅染色情況比較 腦組織蘇木精-伊紅染色結果顯示，對照組腦組織細胞完整且排列整齊，無變性壞死，可見少量細胞脂質沉積；4-VO模型組腦組織細胞體積縮小、核固縮深染；TGP組和4-VO+TGP組可見少量腦組織細胞體積縮小和核固縮深染，均較4-VO模型組明顯減輕，見圖1。

2.5四組大鼠腦組織細胞TNUEL染色情況 對照組、4-VO模型組、TGP組、4-VO+TGP組的大鼠凋亡細胞比例分別為(3.6±1.2)%、(48.3±6.4)%、(4.2±2.3)%、(22.6±4.2)%，各組比較差異有統計學意義(F=38.145，P<0.001)，與對照組相比，4-VO模型組大鼠凋亡細胞比例明顯升高(P<0.01)；而與4-VO模型組相比，4-VO+TGP組凋亡細胞比例均明顯降低(P<0.01)；對照組與TGP組凋亡細胞比例比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖2。

表2 TGP對MCAO大鼠MDA、ROS、NO、NOS、SOD水平的影響

1a：對照組；1b：4-VO模型組；1c：TGP組；1d：4-VO+TGP組

DAPI：染色體熒光原位雜交；TUNEL：原位末端轉移酶標記技術；Merge：合成

2.6四組大鼠腦組織中TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3蛋白表達比較 免疫組織化學結果顯示，與對照組相比，4-VO模型組大鼠腦組織TLR4表達明顯增加，而4-VO+TGP組TLR4表達較4-VO組明顯減少，見圖3。Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，4-VO模型組大鼠腦組織中TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3表達明顯增加，而4-VO+TGP組TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3表達較4-VO模型組明顯減少，見圖4。

3 討 論

TLR是氧化應激反應的重要蛋白分子，主要參與機體的非特異性免疫[11-14]。TLR種類較多，不同部位分布的類型也不一致。TLR4是中樞神經系統分布最廣泛的TLR，其可通過識別細菌脂多糖和壞死細胞的熱激蛋白發生一系列級聯反應，進而造成神經細胞的損傷。大量研究表明，TLR4參與了阿爾茨海默病、帕金森病等疾病的發生和發展[15-16]，并與腦缺血后神經損傷和炎癥反應密切相關[17]。有研究發現，腦缺血后腦組織中TLR4表達明顯增多，NF-κB激活后轉入細胞核內，可促進MDA、ROS、NO、NOS等氧自由基的表達，隨后與星形膠質細胞結合，促進了caspase-3激活誘導的細胞凋亡，并可下調星形膠質細胞膜上谷氨酸轉運體的表達，造成谷氨酸大量堆積，最終導致神經元的死亡[18]。

3a：對照組；3b：4-VO模型組；3c：TGP組；3d：4-VO+TGP組

TLR4：Toll樣受體4；p-ERK：磷酸化胞外信號調節激酶；p-JNK：磷酸化c-Jun氨基端激酶；p-p38：磷酸化p38；NF-κB：核因子κB；caspase：胱天蛋白酶；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；A：對照組；B：4-VO模型組；C：TGP組；D：4-VO+TGP組

以氧化應激反應為靶點探究治療腦缺血再灌注損傷的新藥物，已成為近年來新的研究熱點。周家文等[19]通過建立MCAO大鼠模型考察人參二醇組皂苷的治療效果和機制發現，銀杏內酯B可通過降低MCAO大鼠血清NOS活性以及NO水平，改善MCAO大鼠腦含水量和病理損傷。陳廣斌等[20]通過比較模型組和丹參素組MCAO新生鼠缺血區腦組織中神經型NOS、誘導型NOS的表達發現，丹參素可顯著降低神經型NOS、誘導型NOS的產生，改善過量NO對腦組織的損傷。本研究結果顯示，與對照組相比，4-VO模型組大鼠腦含水量和腦梗死體積明顯升高，血清MDA、ROS、NO、NOS水平顯著升高，SOD水平顯著下降；同時，病理結果也顯示，4-VO 模型組大鼠缺血腦組織中細胞體積明顯縮小、核固縮深染，提示造模成功。4-VO+TGP組可顯著改善大鼠MCAO的病理表現和氧化應激水平，且單獨使用TGP對正常大鼠的影響較小，證明TGP對治療MCAO具有一定的應用前景；此外，檢測TLR4信號通路相關蛋白的改變顯示，4-VO模型組大鼠腦組織中TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3表達水平明顯高于對照組，而4-VO+TGP組大鼠TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3均較4-VO模型組明顯下降，由此推斷，大鼠MCAO可誘導TLR4通路激活，使TLR4、p-JNK、p-ERK、p-p38、NF-κB、caspase-3蛋白表達升高，而TGP可抑制TLR4通路激活。本研究在一定程度上證實了TGP對大鼠MCAO的治療作用，但由于MCAO發病復雜，本研究樣本量有限，實驗方法單一，實驗結果可能存在偏差，故仍需大樣本量、多種實驗方法的驗證。

綜上所述，TGP可改善MCAO大鼠腦組織損傷，其機制可能與激活TLR4信號通路，抑制氧化應激反應有關。