四種特殊染色在淚道放線菌感染診斷中的應用

楊琦 畢穎文 蔡蓉蓉

摘要：目的 ?探討六胺銀、PAS、革蘭染色和抗酸染色4種特殊染色在淚道放線菌感染診斷中的應用。方法 ?收集2010年12月～2019年6月復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院眼科收治的淚道放線菌感染患者30例，分析該病六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色4種特殊染色方法的鏡下表現。結果 ?常規HE染色鏡下下可見散在菌落樣結構，菌絲結構不清，染色淺淡;六胺銀、PAS和革蘭染色3種特殊染色方法，鏡下均可見放線菌分別呈棕黑色、紫紅色和紫藍色，呈陽性染色;并于低倍鏡下可見放線菌菌落呈典型的菊花樣外觀，高倍鏡下可見放線菌菌絲。抗酸染色示，鏡下所有組織細胞均呈藍色，無特異性呈陰性染色。結論 ?六胺銀、PAS、革蘭染色及抗酸染色的聯合應用有助于淚道放線菌感染的診斷及鑒別診斷。

關鍵詞：淚道炎;放線菌;六胺銀;PAS革蘭染色;抗酸染色

中圖分類號：R777.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2020.11.055

文章編號：1006-1959（2020）11-0168-03

Abstract：Objective ?To explore the application of four special stains of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain in the diagnosis of lacrimal actinomycete infection.Methods ?A total of 30 patients with lacrimal actinomyces infection admitted to the Department of Ophthalmology， Otolaryngology and Affiliated Hospital of Fudan University from December 2010 to June 2019 were collected， the microscopic performance of the disease with four special staining methods including hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain was analyzed.Results ?Under the conventional HE staining microscope， scattered colony-like structures can be seen， the mycelium structure is unclear， and the staining is light; There are three special staining methods for hexaamine silver， PAS and Gram staining， and the actinomycetes can be seen under the microscope as brown-black， purple-red and purple-blue， with positive staining; The actinomycete colonies can be seen under a low magnification lens with a typical chrysanthemum-like appearance， and the actinomycete hyphae can be seen under a high power microscope. Acid-fast staining showed that all tissue cells were blue under the microscope， and there was no specific negative staining.Conclusion ?The combined application of hexaamine silver， PAS， Gram stain and acid-fast stain is helpful for the diagnosis and differential diagnosis of lacrimal actinomycete infection.

Key words：Lacrimal inflammation;Actinomycetes;Hexaaminesilver;PAS Gram stain;Acid-fast stain

淚道感染（lacrimal duct infection）是眼部常見的炎癥性病變，主要癥狀為溢淚，粘性或膿性分泌物及結膜充血，常見的致病菌為金黃色葡萄球菌和表皮葡萄球菌，常規采用淚道沖洗并配合抗生素滴眼液治療。淚道放線菌感染比較少見，臨床表現同淚道細菌感染相似，僅淚道沖洗及抗生素治療效果常無效，須經淚道切開，將放線菌形成的小菌落即硫磺顆粒取出，再行注藥并配合抗生素滴眼液治療。因此精確的診斷對患者的后續治療至關重要。放線菌屬于放線菌屬[1]，常寄生于人體的口腔、扁桃體隱窩、上呼吸道、胃腸道和泌尿生殖道等多個器官或組織，是一種條件致病菌，當身體抵抗力降低時或條件適合其生長時，便明顯增殖，出現臨床癥狀，導致局部組織的化膿性炎癥[2]。在培養基上培養放線菌，其形態結構難與真菌相鑒別，因此，組織病理檢測及其特殊染色對于放線菌的診斷尤為重要。本研究通過分析我院30例淚道放線菌感染病例，分析六胺銀、PAS、革蘭染色和抗酸染色四種特殊染色診斷淚道放線菌感染的特點，以期為指導臨床治療提供參考，現報道如下。

1資料與方法

1.1一般資料 ?收集2010年12月～2019年6月復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫院30例眼科收治的診斷結果為淚道放線菌感染病例。其中女24例，男6例;年齡39～85歲，平均年齡64.6歲;左眼9例，右眼13例，雙眼1例，左右眼情況不詳7例。最常見入院癥狀為流淚，溢淚增多，其次為粘液樣分泌物伴黃白色分泌物和流膿，部分伴有眼紅眼痛和異物感。患者行淚道切開術后見放線菌顆粒，亦稱硫磺顆粒，常規病理送檢，并進行HE染色和六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色四種特殊染色。

1.2方法 ?患者行淚道切開術取出放線菌形成的小菌落樣結構即硫磺顆粒，并送檢，標本經10%福爾馬林固定，經梯度脫水和梯度透明后浸蠟包埋，并制成厚度為4 μm的白片各5張。并分別進行常規HE染色和六胺銀、PAS、革蘭染色、抗酸染色四種特殊染色（所有試劑盒均來源于珠海貝索公司）。

1.2.1 HE染色 ?操作方法：①切片常規脫蠟至水;②58 ℃熱蘇木素染色2～3 min后流水沖洗。③鹽酸酒精分化2～3 s，流水沖洗;④溫水10 s返藍;⑤95%酒精浸泡2 min;⑥直接入醇溶性伊紅染液15～30 s;⑦梯度脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.2六胺銀染色 ?操作方法：①工作液配置：50 ml硼砂溶液+0.5 g六次甲基四胺銀粉劑，用力搖勻5～10 min，再將六次甲基四胺銀液全部倒入硼砂溶液中，重復此步驟3次，確保六次甲基四胺銀內粉劑被充分溶解;②將切片常規脫蠟至水;③將高碘酸滴到玻片上充分覆蓋組織并氧化10分鐘后蒸餾水沖洗2 min;④將沖洗好的玻片放入裝有染色液的試劑缸中，再放到盛有60 ℃熱水的容器瓶并置于85 ℃烘箱中約20～30 min，直至切片在黃棕色的背景中見到黑棕色反應，如果顏色不夠深可以再放回染色液中。⑤硫代硫酸鈉處理3 min，水洗;⑥伊紅復染30 s;⑦常規脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.3 PAS染色操作方法 ?①常規脫蠟至水;②將高碘酸滴到玻片上充分覆蓋組織并氧化10 min，水洗;③將雪夫試劑滴到玻片上并充分覆蓋組織，染色10～15 min，水洗;④蘇木素液染核2 min;⑤常規脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.4革蘭染色 ?操作方法：①常規脫蠟至水;②滴加龍膽紫液染10～15 s，水洗;③玻片滴加碘溶液，并充分覆蓋組織，染色10～15 s，水洗;④加脫色液（丙酮、乙醇）脫色20～30 s，水洗;⑤沙黃溶液復染15 s，水洗;⑥常規脫水透明，中性樹膠封固。

1.2.5抗酸染色 ?操作方法：①常規脫蠟至水;②滴加石炭酸復紅染液蓋滿玻片;染色10～15 min，水洗;③滴加酸性酒精溶液，脫色1～2 min，直至組織無可視紅色為止，水洗;④滴加亞甲基藍溶液于玻片上并充分覆蓋組織，染色2 min，水洗;⑤常規脫水透明，中性樹膠封固。

2結果

HE鏡下可見急慢性炎細胞浸潤，出血，部分可見嗜伊紅無結構分泌物，并均可見散在的中間藍色，周圍紅色，顏色淺淡的菌落樣結構，見圖1;六胺銀染色：30例組織鏡下均見菌落及菌絲呈黑棕色，菌落呈菊花樣外觀。背景棕黑色，對比鮮明，見圖2;PAS 染色：30例組織鏡下均見菌落及菌絲呈紫紅色，菌落呈菊花樣外觀，對比鮮明，見圖3;革蘭染色 ?30例組織鏡下均見紫藍色菌絲及菊花樣菌落結構，見圖4;抗酸染色：30例組織均呈陰性（鏡下所有組織均呈藍色），見圖5。

3討論

放線菌為革蘭陽性厭氧或微需氧菌，生長緩慢，無芽孢，致病菌多為衣氏放線菌[3]。放線菌感染多為慢性無痛性，常伴有多發瘺管形成，可排出黃色硫磺顆粒，將硫磺顆粒置于玻片上，蓋上蓋玻片，輕輕壓平后顯微鏡檢查，可見顆粒呈菊花狀，由棒狀長菌絲呈放射狀排列[1]。本研究發現淚道放線菌感染臨床并不常見，其主要癥狀包括溢淚、粘性及膿性分泌物，因臨床癥狀不典型，易被誤診，臨床需注意與功能性溢淚、淚囊憩室、淚囊囊腫和結膜炎相鑒別。在淚小點或淚道處出現“硫磺顆粒”（結石樣物）這一現象是淚道放線菌感染的特征性的病理改變[5]，常由患者機體抵抗力下降后內源性感染引起。本研究中老年的女性居多可能與該年齡段患者抵抗力相對較差有關。

放線菌菌培養的陽性率較低，僅在50%左右，病理診斷是放線菌診斷的金標準[6]。以往關于放線菌病理診斷及鑒別診斷方面的研究僅為一種或兩種特殊染色的個例或小樣本的系列研究，本組是四種特殊染色聯合應用的較大的樣本研究。淚道放線菌感染送檢標本的常規HE染色結果，鏡下可見急慢性炎細胞浸潤，有的可見嗜伊紅均質分泌物，并可見散在菌落樣物，但菌落及菌絲染色淺淡，缺乏特異性，不僅觀察困難，而且容易漏診。此外，六胺銀染色能夠對放線菌及其菌落進行很好的染色，對比清晰，低倍鏡下，放線菌菌落呈典型的菊花樣結構，高倍鏡下可見黑棕色菌絲呈放射狀排列，對診斷結果至關重要，缺點是耗時長，同時工作液不能接觸金屬離子，所以沖洗液最好選用蒸餾水，同時高碘酸沖洗要充分，避免造成嚴重背景色，并且染色時間不好掌握，容易過染，耗材貴。本組PAS染色，放線菌菌落呈菊花樣外觀，菌絲呈紫紅色，耗時短，操作簡單，是準確性高，時效性好的特殊染色方法。本組革蘭染色，放線菌呈紫藍色，主要用于同革蘭陰性菌相鑒別。臨床上，大多數放線菌的革蘭染色只用于細胞涂片或者細菌培養后的特殊染色。從組織學角度對組織內的放線菌進行革蘭染色，得到了同樣好的染色結果。本組抗酸染色的主要作用在于將放線菌與麻風桿菌和結核桿菌相鑒別，也佐證了放線菌呈抗酸染色陰性。因此在常規HE下發現中間藍色，周圍紅，染色淺淡的菌落樣結構，并配合四種特殊染色的染色結果，即在六胺銀、PAS、革蘭染色中，低倍鏡下觀察到典型的菊花樣外觀的菌落及高倍鏡下看到桿狀菌絲呈放射狀排列并呈陽性著色;同時抗酸染色看不到陽性著色即可診斷為放線菌感染。

本組關于淚道炎放線菌感染與其他菌群相鑒別的研究發現，淚道炎的致病菌按革蘭染色結果和形態可分為革蘭陽性球菌、革蘭陽性桿菌、革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌以及真菌和放線菌。①放線菌與革蘭陰性菌（革蘭陰性球菌和革蘭陰性桿菌）相鑒別：放線菌為革蘭陽性菌，利用革蘭染色結果，可將其與革蘭陰性菌相鑒別。②放線菌與革蘭陽性菌（革蘭陽性球菌和革蘭陽性桿菌）相鑒別：淚道感染中革蘭陽性球菌較為常見，多見表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌;革蘭陽性桿菌較少見，偶見假白喉棒狀桿菌[4];因金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和假白喉棒狀桿菌菌體太小在常規HE下難以發現，即使看到也是極小的點狀結構;同時它們的六胺銀及PAS染色分別呈棕黃色和粉色背景色，呈陰性表達。結合特殊染色可以與放線菌相鑒別。表皮葡萄球菌和金黃色葡萄球菌診斷主要靠細菌培養。假白喉棒狀桿菌的鑒定主要依靠細菌培養、革蘭染色和生化實驗;③放線菌與真菌相鑒別：淚道炎常見的真菌為白假絲酵母菌。白假絲酵母菌為革蘭染色陽性真菌，同時六胺銀和PAS也均呈陽性，抗酸為陰性，但是其鏡下結構完全不同，放線菌菌絲纖細0.1～0.5 μM 菌落呈放射狀，六胺銀和PAS染色后鏡下可見典型的菊花樣菌落結構。在組織切片中，白假絲酵母菌主要位于黏膜表面的滲出物及壞死組織內，菌體呈球形或卵圓形，直徑為3～6 μM，形成芽生孢子，孢子伸長成芽管（內有空泡樣結構），不與母體脫離，繼而形成假菌絲。后者常帶有球狀成堆的芽生孢子，菌絲內有核，可見分隔、分枝，也見厚膜孢子[7]。

綜上所述，六胺銀、PAS、革蘭染色及抗酸染色結果結合常規HE對放線菌的診斷及鑒別診斷有重要作用。

參考文獻：

[1]倪語星，尚紅.臨床微生物檢驗[M].第5版.北京：人民衛生出版社，2014：214-216.

[2]劉立民，高寧洲，楊蕾蕾，等.慢性淚囊炎合并放線菌淚小管炎一例[J].中國實用眼科雜志，2016，34（4）：398-399.

[3]井夢昕，周賢梅.左上肺放線菌病一例誤診分析[J].臨床誤診誤治，2017，30（4）：15-17.

[4]孔京慧，章波，宋銀森.嬰幼兒淚囊炎1482例眼分泌物細菌培養及藥敏分析[J].中華眼外傷職業病雜志，2018，40（9）：699-701.

[5]Nair AG，Potdar NA，Gore SS，et al.Actinomycetes canaliculitis complicating congenital nasolacrimal duct obstruction in an infant[J].Indian J Ophthalmol，2018，66（4）：574-577.

[6]張子敬，高志清，謝波，等.腹部放線菌病1例[J].中國感染與化療雜志，2018，18（3）：309-311.

[7]鄭葉，曾東，童海濤，等.特殊染色技術在艾滋病合并真菌病理診斷中的應用[J].中華臨床感染雜志，2004，7（3）：207-211.

[8]Chou YP，Yeh PH，Tsai YJ，et al.Infectious keratitis secondary to canaliculitis with concretions：A case report[J].Medicine（Baltimore），2019，98（40）：e17444.

收稿日期：2020-02-27;修回日期：2020-04-18

編輯/馮清亮