養殖牙鲆致病性弧菌的鑒定及藥敏分析

高楊

摘?要：2020年丹東東港市某養殖廠養殖1齡牙鲆（Paralichthys olivaceus）突發病害，表現為腹水病癥狀。取患病的5尾養殖牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水為材料進行細菌分離及純培養，選擇優勢菌株通過全自動細菌分析儀及16S rDNA序列分析對該菌株進行鑒定，結果表明分離純培養的14株菌（DS200401-DS200414）共鑒定出2種，其中1種為該病的致病菌：弧菌屬燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。隨后進行人工感染試驗和藥敏試驗。用12種抗菌藥物對3種菌進行藥敏試驗， 結果顯示在不同菌株間無明顯的敏感與耐藥性差異。

關鍵詞：牙鲆（Paralichthys olivaceus）;燦爛弧菌（Vibrio splendidus）;藥敏試驗

丹東東港市8 667 hm2（13萬畝）海水池塘普遍采用多品種立體生態養殖模式[1]，牙鲆（Paralichthys olivaceus）作為混養的重要海水低溫經濟品種[2]，屬于蝶形目（Pleuronectiformes），鲆科（Bothidae），牙鲆屬（Paralichthys），由于肉質鮮美，深受消費者喜愛。在牙鲆養殖過程中，由于操作管理不當和投喂冷凍野雜魚的養殖方式，增加了細菌感染的風險，常常導致細菌病爆發，造成巨大的經濟損失，制約牙鲆養殖業的發展。2020年丹東東港市某養殖場大面積暴發牙鲆腹水病，主要病原是燦爛弧菌（Vibrio splendidus）。筆者對該養殖場患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，對分離出的致病菌進行了16S rDNA序列分析、藥敏試驗，為養殖牙鲆的病害研究提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?試驗材料

2020年4月東港市某牙鲆養殖戶反映，患病牙鲆表現為體色發黑，眼球突出，腹水嚴重，直至全部感染。送檢的5尾瀕死牙鲆，體長約25.31～29.86 cm。健康牙鲆取自東港市某養殖場。

1.2?試驗方法

1.2.1?肉眼檢查及剖檢?肉眼觀察患病牙鲆的體表癥狀，解剖病魚，對鰓組織進行鏡檢，并記錄。

1.2.2?細菌分離?在無菌條件下，取患病的1齡牙鲆的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，用接種環接種于2216E瓊脂海水培養基和硫代硫酸鹽檸檬酸鹽膽鹽蔗糖瓊脂（TCBS）培養基上[3-4]，劃線分離，28 ℃恒溫培養箱培養24 h，挑取優勢菌的單菌落，在胰酪大豆胨瓊脂培養基（TSA）平板上純化培養。

1.2.3?細菌鑒定

1.2.3.1?分子生物學鑒定?對分離菌株進行常規16S rDNA基因序列鑒定，將得到的產物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。將測序結果在NCBI網站上進行BLAST比對。選取同源性較高的序列，采用 Clustal X 1.83軟件進行多重序列比對分析，并通過MEGA 6軟件采用鄰接法構建系統發育樹。

1.2.3.2?生化鑒定?采用法國生物梅里埃公司生產的微生物自動分析系統進行生化特征分析。

1.2.4?人工感染試驗?試驗牙鲆為東港地區某養殖場健康牙鲆10尾，體長8～10 cm，暫養于兩個200 L水族箱中，溫度控制在15 ℃，充氧并少量投食。試驗組與對照組各10 L水體分別放入5尾牙鲆，采用注射感染[5]方法，每尾魚注射0.05 mL約108 cfu/mL的菌懸液，對照組注射 0.05 mL無菌生理鹽水。觀察記錄發病癥狀及死亡情況。

1.2.5?藥敏試驗?對所分離并經鑒定的菌株，采用[6]瓊脂擴散紙片法（K-B）進行對常用抗菌類藥物的敏感性測定。

2?結果與分析

2.1?發病情況及主要病變

2020年4月東港市某牙鲆養殖場反映，3月20日左右，十余家養殖戶養殖的1齡牙鲆，經室內越冬池轉移到室外土池塘時，均出現魚體發黑，眼球突出，腹部膨大，停止攝食最終死亡。共計養殖牙鲆100萬尾，病死率高達67.6%。送檢的5尾患病牙鲆，體長約25.31～29.86 cm，鰓絲完好，1尾體表有潰爛，解剖后5尾魚存在白色混濁腹水，肝臟脾臟腫大，腸壁出現充血水腫，腸道內無食物且充滿淡黃色黏液，1尾腸道內有白色線團狀物。

2.2?病原形態特征

取病魚的鰓、肝、脾、腸道、腹水進行細菌分離與鑒定，從鰓上分離出一株細菌，只在2216E平板上生長，形成圓形光滑，邊緣整齊突出，白色較小的菌落。在脾臟、腸道、腹水中分離出的細菌，同時生長于2216E平板和TCBS平板，形成圓形光滑，黃色突起的菌落，大小有差異。革蘭氏染色后在顯微鏡下觀察為革蘭氏陰性菌。

2.3?病原菌的生理、生化鑒定

由全自動細菌分析儀對病原菌的生理生化檢測結果可知，該病原菌初步鑒定為弧菌屬細菌。

將分離菌所擴增的16S rDNA基因序列進行Blast比對結果顯示，從鰓上分離出的菌株 DS200401為腸桿菌。從脾臟，腸道，腹水中分離出的菌株DS200404、DS2004008、DS2004013基因與燦爛弧菌（Vibrio splendidus）相應基因相似率達98%。分離菌所擴增的16S rDNA基因序列提交到GenBank，獲得序列號為MT445177-MT445179，所構建的系統發育樹見圖1，菌株與燦爛弧菌聚為一支。

2.4?人工感染試驗

試驗組的5尾牙鲆魚感染后的4～5 d死亡2尾，發病3尾，解剖觀察肝臟脾臟出現腫大，腸道有黃色黏液，3尾魚有腹水。對發病牙鲆進行細菌分離鑒定，結果與原感染菌一致 。

2.5?藥敏試驗

藥敏試驗結果顯示，三株細菌DS200404、DS2004008、DS2004013對氟苯尼考、多西環素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等抗生素敏感，對青霉素、制霉菌素耐藥（表1）。不同菌株間耐藥差異不明顯。

3?討論

作者首次從丹東地區患病的牙鲆體內分離出三株菌，并命名為DS200404、DS2004008、DS2004013。經鑒定均為燦爛弧菌。該菌是刺參腐皮病[7-9]的主要病原，感染牙鲆的文章還未見報道。通過人工感染試驗可知，該菌是致病菌，也是牙鲆細菌病的主要病原之一。

牙鲆弧菌病發于春夏季節[4，5，10]，尤其早春季節危害最為嚴重 。養殖牙鲆經歷越冬期后，免疫力較低，放入土池后，由于環境改變，易發生細菌感染;池塘清池時若殘留漂白粉等藥物，易造成牙鲆藥物中毒;傳統的投喂冷凍野雜魚的養殖方式[11]，增大了牙鲆細菌感染的風險。

由藥敏試驗結果可知，燦爛弧菌對氟苯尼考、多西環素、恩諾沙星、諾氟沙星、氧氟沙星、環丙沙星等6種抗生素敏感。在防治水產生物細菌性疾病時不要濫用[12]抗生素類藥物，避免細菌耐藥性的產生，增加病害控制的難度。確定藥物的最低有效濃度及菌株的耐藥性是下一步工作的方向。

通過以上檢測結果可知，此次牙鲆魚養殖池暴發的腹水病主要病原是燦爛弧菌，建議養殖戶在養殖過程中保證良好水質，選擇優質餌料，提高魚體抗病力，并用配合飼料替代冷凍野雜魚降低感染風險。

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（收稿日期：2020-06-02）