Klotho激活自噬對氧化低密度脂蛋白介導的人冠狀動脈內皮細胞衰老的影響

毛琦，鄧夢楊，李祿豐，趙曉輝

陸軍軍醫大學新橋醫院心內科，重慶 400037

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)被歸類為衰老性疾病[1]，組織病理學研究顯示血管衰老與AS密切相關[2]。進展期AS斑塊呈現出細胞周期停滯、表觀遺傳學修飾及端粒縮短等一系列衰老表征；血管細胞衰老促進了AS的發生及斑塊的進展[3-4]。血管內皮既是簡單的機械屏障，又發揮著重要的抗AS作用[5]。內皮衰老可引起血管通透性增加、舒縮失調、凝血障礙及慢性炎癥[6]，進而導致脂質沉積、剪應力變化、泡沫細胞及微血栓形成，從而促進AS的形成[7]。因此，改善內皮細胞衰老有助于延緩AS進程，具有重要的科學意義及臨床價值。

循環Klotho蛋白主要由腎臟近曲小管產生，是體內重要的多效性激素樣因子，其水平與組織衰老及個體壽命密切相關[8-9]。敲除Klotho的小鼠顯示出血管僵硬、鈣化及AS的衰老表型，而外源性補充Klotho可以明顯改善血管病變程度[9]。自噬是真核細胞“自我消化”的一種保守生物學行為，適度激活自噬有助于維持血管穩態及機體健康[10-11]。Klotho對AS的保護效應可能源于其抗衰老作用，然而，既往對于Klotho抗衰老的認識主要基于“自由基損傷及抗氧化理論”，Klotho與自噬在心血管疾病中的關系尚不清楚[12-13]。本研究擬從內皮活力、衰老程度、細胞自噬等幾個方面探討代謝應激條件下Klotho是否可以通過調節自噬改善內皮細胞衰老。

1 材料與方法

1.1實驗細胞及主要試劑 人冠狀動脈內皮細胞(HCAEC)及ECM培養基(美國Sciencell公司)，胎牛血清及胰酶(美國Gibico公司)，Klotho蛋白(美國RD公司)，氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL，廣州奕源生物公司)，CCK-8細胞活力檢測試劑盒(武漢博士德生物公司)，SA-β-GAL衰老染色試劑盒、一抗β-actin(小鼠單抗，上海碧云天生物公司)，一抗P53、P16、LC3、P62(兔單抗，美國Abcam公司)，腺病毒GFPLC3(上海漢恒生物公司)，山羊抗鼠二抗、山羊抗兔二抗(北京中杉金橋公司)，FITC綠色熒光標記山羊抗兔二抗、Alexa Fluor 647紅色熒光標記山羊抗兔二抗(美國Invitrogen公司)，ECL化學發光試劑盒(美國Millipore公司)，雷帕霉素(美國MCE公司)，氯喹(美國Sigma公司)。

1.2細胞培養及處理分組 ①將HCAEC接種在含有5%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 mg/ml鏈霉素的ECM內皮細胞專用培養基中，于5%CO2、37 ℃條件下培養。②當HCAEC融合至70%左右時，分別向培養基中加入100、200、400、800 pmol/L的Klotho預處理2 h，并用0、25、50、75、100 μg/ml 的ox-LDL分別處理細胞24、48、72及96 h，檢測HCAEC的增殖活力及衰老水平，確定ox-LDL及Klotho的處理濃度，最終選擇400 pmol/L Klotho及75 μg/ml ox-LDL處理細胞72 h作為干預衰老較為合適的實驗條件[14]。③以400 pmol/L Klotho、75 μg/ml ox-LDL以及75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho分別預處理細胞2 h并繼續培養72 h，SA-β-GAL染色檢測衰老細胞，細胞免疫熒光檢測P53及P16蛋白在胞內的表達。④在ox-LDL (75 μg/ml) 處理條件下，分別以400 pmol/L Klotho、5 μmol/L雷帕霉素、2 μmol/L 氯喹、400 pmol/L Klotho+2 μmol/L氯喹預處理細胞2 h，并繼續培養72 h，CCK-8法檢測細胞活力，SAβ-GAL染色檢測衰老細胞，轉染腺病毒GFP-LC3檢測細胞自噬水平，Western blotting檢測P53、P16、LC3及P62蛋白的表達[15]。

1.3CCK-8法檢測HCAEC細胞增殖活力 將1×105/ml密度的細胞懸液以每孔100 μl接種于96孔板中，待細胞全部貼壁生長且融合度達70%時，將細胞分為對照組與ox-LDL處理組，用0、25、50、75、100 μg/ml的ox-LDL分別處理細胞24、48、72及96 h。處理完成后，于每孔加入10 μl CCK-8溶液，在細胞培養箱中孵育1 h；取出96孔板，置于酶標儀在450 nm波長處測定每孔的吸光度值，結合空白對照計算細胞的增殖活力相對值。

1.4SA-β-Gal染色檢測衰老染色陽性細胞比例 將1×105/ml密度的細胞懸液接種于6孔板中，待細胞全部貼壁生長且融合至約70%時，將細胞分為對照組、400 pmol/L Klotho處理組、75 μg/ml ox-LDL處理組以及75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho處理組；處理72 h結束后，棄去培養基，PBS溶液漂洗2次，于每孔加入1 ml的染色固定液室溫固定15 min，吸除固定液，并用PBS溶液漂洗3次，每次3 min；每孔加入1 ml配制好的染色液，用parafilm膜封住孔板邊緣以免蒸發，將6孔板置于無CO2的37 ℃培養箱中孵育過夜；第2天于倒置顯微鏡下觀察染色情況，任意選取每孔的5個視野進行染色陽性細胞計數，并統計陽性細胞百分比。

1.5Western bloはing檢測衰老相關蛋白P53、P16及自噬相關蛋白LC3、P62的表達 將細胞分為75 μg/ml ox-LDL處理組、75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho處理組、75 μg/ml ox-LDL+5 μmol/L雷帕霉素處理組、75 μg/ml ox-LDL+2 μmol/L氯喹處理組、75 μg/ml ox-LDL+400 pmol/L Klotho+2 μmol/L氯喹處理組，從培養箱取出處理后的6孔板，每孔加入250 μl含苯甲基磺酰氟(PMSF，終濃度1 mmol/L)的RIPA裂解液，刮取細胞后置于冰上裂解混勻，4 ℃、12 000 r/min離心10 min后收集上清蛋白，并用BCA法進行蛋白定量。配制SDS-PAGE凝膠，每泳道加入50 μg蛋白樣本，以恒壓模式電泳跑膠，5%濃縮膠階段電壓80 V，時間30 min，分離膠階段電壓120 V，時間90～100 min。當Marker條帶徹底分離或溴酚藍接近凝膠下緣時終止電泳；切膠，以恒壓90 V轉膜60 min，TBST洗滌后，Quick Block封閉液室溫封閉2 h，PVDF膜按各自轉膜的目標蛋白放入相應的一抗(P53、P16、LC3、P62、β-actin單抗)孵育盒中4 ℃過夜；第2天取出，TBST洗膜3次，每次10 min，加入相應二抗(1:5000)于37 ℃孵育1 h；TBST洗滌后曝光，以LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值反映自噬水平，以β-actin作為內參照。

1.6細胞免疫熒光觀察衰老相關蛋白的表達 取出培養在6孔板中的細胞爬片，4%多聚甲醛室溫固定15 min，洗滌后用0.1% Triton-X處理10 min，漂洗后加入Quick Block封閉液室溫封閉15 min；在爬片中心滴加30 μl按1:250稀釋的P53一抗或P16一抗，將其放入鋪有濕紗布的濕盒內，4 ℃避光過夜孵育；第2天取出并漂洗爬片，滴加30 μl熒光標記的二抗稀釋液(1:2500；FITC綠色熒光二抗處理P53；Alexa Fluor 647紅色熒光處理P16)，37 ℃避光孵育1 h，洗滌3次；滴加少許DAPI進行細胞核染色，處理3 min后洗滌，濾紙吸去多余水分，滴加10 μl防淬滅封片劑于載玻片上，輕輕蓋上爬片，使細胞面接觸封片液，并盡量避免產生氣泡；激光共聚焦顯微鏡下觀察細胞免疫熒光情況。

1.7轉染腺病毒GFP-LC3檢測細胞自噬的變化 將生長良好的細胞以1×105/ml密度接種于共聚焦培養皿中，待其融合至60%左右取出；每皿加入8 μl的病毒液，使每皿的病毒MOI值均達到50，37 ℃孵育2 h后更換新培養基；感染24 h后，向各皿施加不同的藥物處理，繼續培養72 h；激光共聚焦顯微鏡觀察代表自噬體形成的綠色熒光亮點，拍照保存后用Image J軟件進行亮點計數。

1.8統計學處理 采用SPSS 24.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，均進行方差齊性檢驗；若方差齊，多組間比較行單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗；若方差不齊，組間比較以Welch法進行近似方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni檢驗。P＜0.05為差異有統計學 意義。

2 結 果

2.1Klotho對ox-LDL介導的HCAEC增殖活力的影響 CCK-8法檢測結果顯示:ox-LDL處理組的細胞活力明顯低于非處理組(P＜0.05)；ox-LDL處理濃度越高，處理時間越長，HCAEC活力越低(P＜0.05)。經過200、400、800 pmol/L的Klotho蛋白預處理后，ox-LDL暴露條件下預處理組的細胞活力較未預處理組明顯改善(P＜0.05，圖1)。

2.2Klotho對ox-LDL介導的衰老陽性細胞比例的影響 ox-LDL組的SA-β-GAL染色陽性細胞比例(50.70%±1.94%)明顯高于對照組(1.32%±0.11%)，ox-LDL+Klotho組的SA-β-GAL染色陽性細胞比例(23.04%±1.69%)明顯低于ox-LDL組，差異均有統計學意義(P＜0.05，圖2)。

2.3Klotho對ox-LDL介導的衰老相關蛋白P53及P16表達的影響 ①細胞免疫熒光檢測結果顯示，P53及P16在胞核及胞質中均有表達，以核內表達為主；ox-LDL處理增加了胞內P53及P16的表達，而外源補充Klotho可以對抗ox-LDL對P53及P16表達的誘導作用(圖3)。②Western blotting檢測結果顯示，隨著ox-LDL處理濃度增加，P53及P16的表達較對照組明顯升高(P＜0.05)；且隨著ox-LDL處理時間的延長，P53及P16的表達較對照組亦明顯升高(P＜0.05)；而外源補充Klotho可以明顯下調ox-LDL誘導的P53及P16表達(P＜0.05，圖4)。

2.4ox-LDL對內皮細胞自噬水平的影響 Western blotting檢測結果顯示:①隨著ox-LDL處理濃度的增加，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值逐漸降低，P62蛋白表達水平逐漸升高，差異均有統計學意義(P＜0.01)。②隨著ox-LDL處理時間的延長，24 h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較對照組明顯升高，而48 h及72 h的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均較24 h明顯降低(P＜0.05)；且24 h的P62蛋白表達水平較對照組明顯降低，隨后逐漸升高且明顯高于對照組(P＜0.05，圖5)。

圖1 Klotho對ox-LDL介導的HCAEC增殖活力的影響(n=3)Fig.1 Effects of Klotho on HCAEC viability under ox-LDL exposure (n=3)

圖2 各組HCAEC衰老細胞SA-β-GAL染色情況(×200)Fig.2 Senescent cells in each group of HCAECs (SA-β-GAL staining, ×200)

2.5Klotho對ox-LDL介導的內皮細胞自噬的影響 ①Western blotting檢測結果顯示:ox-LDL+Klotho組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較ox-LDL組明顯升高，而P62蛋白表達則明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值較ox-LDL+氯喹組增加，而P62蛋白表達降低(P＜0.05)。②腺病毒GFPLC3熒光檢測結果顯示:ox-LDL+Klotho組的自噬體較ox-LDL組明顯增多(P＜0.05)；且Klotho可以明顯增加受ox-LDL及CQ共同抑制的胞內自噬體數量(P＜0.01，圖6)。

2.6 K lotho調節自噬對ox-LDL介導的內皮細胞衰老的影響 ①CCK-8法檢測結果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組的細胞活力明顯高于ox-LDL組(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的細胞活力較ox-LDL組明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的細胞活力較ox-LDL+氯喹組明顯增加(P＜0.01)。②SA-β-GAL細胞染色結果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組衰老陽性細胞的比例較ox-LDL組明顯減少(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的陽性細胞比例較ox-LDL組明顯增加(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的衰老陽性細胞比例較ox-LDL+氯喹組明顯減少(P＜0.01)。③Western blotting檢測結果顯示:ox-LDL+Klotho組及ox-LDL+雷帕霉素組的P53及P16蛋白表達較ox-LDL組明顯降低(P＜0.01)；ox-LDL+氯喹組的P53及P16蛋白表達較ox-LDL組明顯升高(P＜0.01)；ox-LDL+Klotho+氯喹組的P53及P16蛋白表達較ox-LDL+氯喹組明顯降低(P＜0.05， 圖7)。

圖3 Klotho對ox-LDL介導的P53及P16表達的影響(免疫熒光染色，×400)Fig.3 Effects of Klotho on ox-LDL-induced P53 and P16 expression in HCAEC(Immunofluorescence staining, ×400)

圖4 Klotho對ox-LDL介導的P53及P16蛋白表達的影響 (n=3)Fig.4 Effects of Klotho on ox-LDL-induced expression of P53 and P16 (n=3)

圖5 ox-LDL對HCAEC自噬的影響(n=3)Fig.5 Effects of ox-LDL on autophagy of HCAEC (n=3)

3 討 論

AS是以血管壁脂質沉積為特征的慢性血管疾病[16]。從循環攝取的LDL在動脈壁轉變為ox-LDL，后者可引起內皮功能障礙，增加黏附分子表達，誘導單核/巨噬細胞轉化為泡沫細胞，進而啟動AS，故被認為是重要的代謝應激原及致AS因子[17-18]。本研究發現，較高濃度的ox-LDL可降低HCAEC活力并增加衰老陽性細胞比例，在其持續作用下，衰老相關蛋白P53及P16的表達也明顯增加，這表明ox-LDL可介導HCAEC的衰老，其促衰老的效應呈現一定的時效/量效關系。進一步研究發現，在ox-LDL介導的HCAEC衰老過程中，細胞自噬也發生了相應變化。隨著ox-LDL處理強度的增加，自噬的介導作用及清除能力均明顯降低，細胞自噬流受到ox-LDL的明顯抑制。在ox-LDL持續暴露下，細胞衰老水平與自噬水平呈明顯正相關，提示自噬可能作為保護機制參與了內皮的衰老進程。值得注意的是，本研究發現，ox-LDL短期處理可引起細胞自噬的短暫激活，而持續作用則會導致自噬的逐漸抑制。這提示應激強度可影響自噬水平，自噬與衰老可能均為細胞應對應激的一種適應方式。基于本研究結果推測，短期應激可上調自噬以代償受損的細胞功能，持續應激則重塑細胞的生物學行為并改變其生存狀態，細胞可能通過調節自噬影響自身結局[19]。

在心血管疾病中，Klotho與自噬的關系尚不明確。近期少量研究顯示，Klotho可能通過調節自噬參與了腎間質及肺組織的重塑；然而，不同疾病模型間的自噬效應差異很大，這顯示了組織的特異性及自噬調控的復雜性，而相關結論也有待評估及驗證[20-21]。本研究進一步發現，Klotho可以激活被ox-LDL抑制的HCAEC自噬，表現為:①Klotho可促進自噬體形成并加快其降解，恢復并激活受損的自噬流。②Klotho可減輕受氯喹抑制的自噬，表現為以P62下調為特征的自噬清除能力的部分恢復，但其對抗氯喹的具體機制仍不清楚。筆者推測Klotho可能有助于改善受損的溶酶體功能，進而加快自噬體降解速率。③在ox-LDL暴露下，雷帕霉素及Klotho具有類似的自噬激活作用；然而，在缺乏應激的條件下，Klotho無法上調自噬，雷帕霉素依然具有激活自噬的作用，提示二者調控自噬的具體靶點可能不同。既往觀點認為，Klotho的抗衰老效應是基于對細胞抗氧化酶的誘導[22]。然而，本研究發現，上調自噬可明顯減輕細胞衰老，抑制自噬則加重衰老程度，Klotho可通過激活自噬改善ox-LDL介導的HCAEC衰老。Klotho基于激活自噬的抗衰老作用可能歸因于應激損傷條件下對內皮細胞生物學行為的重塑，亦即通過自噬的“自我清除”機制減少受損細胞器、清除異常蛋白、降低氧化應激水平，從而實現細胞自穩[23]。既往研究提示，循環Klotho水平與胰島素抵抗相關，胰島素及其信號通路也參與了代謝應激及衰老進程，筆者推測Klotho可能通過胰島素/胰島素樣生長因子1(IGF-1)通路影響自噬水平[24]。另有研究提示，腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)依賴的信號通路與能量代謝及組織衰老關系密切，自噬信號感受器mTOR蛋白亦是AMPK途徑的關鍵下游靶點，Klotho也可能通過AMPK信號途徑調控細胞自噬[25]。在下一步工作中，本課題組將針對Klotho調控內皮細胞自噬的具體分子機制進行更為深入的研究。

圖6 Klotho對ox-LDL介導的HCAEC自噬的影響 (n=3)Fig.6 Effects of Klotho on ox-LDL-induced autophagy in HCAEC (n=3)

圖7 Klotho調節自噬對ox-LDL介導的HCAEC衰老的影響 (n=3)Fig.7 Effects of Klotho on ox-LDL-induced HCAEC senescence via regulation of autophagy (n=3)

綜上所述，Klotho可通過激活自噬改善ox-LDL介導的人冠狀動脈內皮細胞衰老。基于抗衰老的心血管防治策略有助于降低冠心病風險，Klotho干預血管內皮自噬或可成為新的抗粥樣硬化靶點。