血清CER、HA和FT3對慢性乙型肝炎肝纖維化的診斷價值

譚立明，葉舒慧，華蕾，郭斌，趙永雷，張皓承，胡澤宇，曹梓超，吳洋，曾婷婷，田永建，余建林，李華，陳娟娟

1南昌大學第二附屬醫院檢驗科/江西省檢驗醫學重點實驗室，南昌 330006；2南昌大學公共衛生學院，南昌 330006；3宜春市萬載縣婦幼保健院，江西宜春 336100；4南昌大學第二臨床醫學院，南昌 330006

慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B，CHB)是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染所致。目前，全世界至少有3.5億CHB患者[1]。HBV不直接殺傷肝細胞，但HBV的活躍復制、肝臟細胞的炎性反應及壞死易使CHB患者肝臟發生纖維化，最終發展成肝硬化及肝細胞肝癌(hepatocellular carcinoma，HCC)。監控CHB患者肝臟纖維化程度，抑制HBV DNA復制、減輕肝臟細胞受損程度，可延緩肝衰竭、肝硬化失代償及HCC等嚴重并發癥的發生，改善CHB患者的預后和生活質量[2]。肝臟是人體銅藍蛋白(ceruloplasmin，CER)、游離三碘甲腺原氨酸(free triiodothyronine 3，FT3)代謝的主要器官，透明質酸(hyaluronic acid，HA)是肝臟細胞外基質的重要成分，肝臟功能異常會導致血清CER、HA和FT3水平異常。本研究探討了血清CER、HA和FT3水平對CHB患者肝臟纖維化程度的評估價值。

1 資料與方法

1.1研究對象 南昌大學第二附屬醫院2014年7月－2018年1月確診的患者200例，包括CHB 136例、乙型肝炎后肝硬化44例、HBsAg陽性原發性肝癌20例。隨機選取同期50例健康體檢者作為對照組。所有患者均符合納入排除標準，所有標本均在患者知情同意條件下獲得。本研究獲得南昌大學第二附屬醫院倫理委員會批準許可。

1.2納入標準 ①CHB患者均符合2018年美國肝病研究學會制定的CHB診斷標準[3]；②肝硬化患者符合《慢性乙型肝炎防治指南》病理診斷標準[1]，肝纖維化分期等級≥S4期；③乙型肝炎后肝硬化患者與HCC患者均按照《APASL臨床實踐指南:肝細胞癌的管理》[4]經過肝臟活檢、肝臟影像學檢查及臨床醫師確診。

1.3排除標準 ①甲、丙、丁、戊型肝炎病毒及人類免疫缺陷病毒(HIV)感染者；②酒精性肝炎、自身免疫性肝炎、原發性膽汁性肝硬化及肝臟轉移性癌癥者；③合并糖尿病，自身免疫性疾病，嚴重心腦血管、心臟、腎臟、血液系統疾病者；④近期接受過影響凝血功能的相關治療者；⑤近期接受過抗肝纖維化治療或抗病毒治療者。

1.4方法 所有研究對象均取3 ml晨起空腹外周靜脈血，靜置30 min后放入離心機中1026×g離心15 min，留取上層血清待檢。血清CER的檢測采用免疫比濁法(美國貝克曼公司產IMMAGE 800型全自動特定蛋白分析系統及配套試劑)。血清HA和FT3的檢測采用化學發光法(美國西門子全自動化學發光免疫分析系統ADVIA Centaur XP)。血小板(PLT)測算采用電阻抗法(SISMEX全自動血液分析儀，型號:XE-2100)，谷丙轉氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉氨酶(aspartate transaminase，AST)的檢測使用Beckman AU5800全自動生化分析儀。所有操作均嚴格遵循各試劑說明書及南昌大學第二附屬醫院質量管理標準 文件。

1.5肝纖維化無創性診斷 采用AST/PLT比率指數(AST-to-platelet ratio index，APRI)與基于4因子的肝纖維化指標(fibrosis index based on four factors，FIB-4)兩種模型分別計算CHB、肝炎后肝硬化及HCC的肝臟纖維化程度。APRI=([AST/ULN*]/PLT)×100；FIB-4=(年齡×AST)/(PLT×ALT0.5)[5-6]。 其中，ULN*為正常值上限40 U/L，AST、ALT單位為U/L，年齡單位為年，PLT單位為109/L。

1.6統計學處理 所有檢測結果經EXCEL 2016軟件整理分類，利用SPSS 20.0軟件進行統計學分析。正態分布數據以±s表示，非正態分布數據以M(P25，P75)表示。對各組數據進行正態性檢驗和方差齊性檢驗(Levene's檢驗)。若同時滿足正態性和方差齊性，采用單因素方差分析(one-way ANOVA)進行組間比較，兩兩比較采用Dunnet t檢驗、SNK法。未同時滿足正態性和方差齊性的數據采用秩和檢驗，兩兩比較采用完全隨機設計多個樣本間多重比較的正態近似法。相關性分析采用Pearson法和Spearman秩相關分析。P＜0.05為差異有統計學意義。對檢驗數據行受試者特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，計算ROC曲線下面積(area under the curve，AUC)，AUC=0.5～0.7為有較低的診斷準確性，AUC=0.7～0.9為有一定的診斷準確性，AUC＞0.9為有較高的診斷準確性。

2 結 果

2.1一般資料 各組間性別比較差異無統計學意義；CHB組和肝硬化失代償組年齡與對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)；重度CHB組、失代償期肝硬化組CER水平均低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；重度CHB組、肝硬化組HA水平均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；肝硬化組、HCC組FT3水平均低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；中重度CHB組、HCC組AST水平均高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；重度CHB組ALT水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05)；CHB組、肝硬化組、HCC組PLT均低于對照組，差異有統計學意義(P＜0.05，表1)。

2.2CER、HA、FT3與肝纖維化APRI、FIB-4的相關性分析 Pearson相關分析結果顯示，CER與APRI、FIB-4呈負相關，HA、FT3與APRI、FIB-4均呈正相關(表2)。

2.3CER、HA、FT3診斷肝硬化的可靠性分析 以肝臟活檢結果為標準，評價CER、HA和FT3水平診斷肝纖維化分期等級≥S4期的可靠性，結果顯示CER、HA敏感度(均為79.1%)高于FT3，FT3的特異度最高，為89.1%(表3)。

2.4CER、HA、FT3診斷肝硬化的ROC曲線分析 CER、HA、FT3診斷肝硬化的AUC分別為0.608、0.826、0.831，三者均具有良好的診斷價值，其中FT3的AUC最大。聯合診斷的診斷效能從高到低依次為CER+HA+FT3、HA+FT3、CER+HA和CER+FT3(圖1)。

3 討 論

據世界衛生組織估計，全球約有2.4億慢性HBV感染者，中國35%～62%的人檢出HBV感染標志物[5-6]。CHB的自然過程可以按照病毒-宿主相互作用分為4個階段:免疫耐受、免疫清除、低復制或無復制及活化。CHB的發病機制較為復雜，迄今尚未完全闡明。研究表明，HBV不直接殺傷肝細胞，其引起的免疫應答是肝細胞損傷及炎癥的主要發生機制，而炎癥反復存在是CHB進展為肝硬化甚至HCC的重要因素[7]。肝纖維化嚴重程度是影響CHB患者預后的一個重要因素，此外，它可以輔助確定患者開始進行抗病毒治療的具體時間，評估抗病毒治療的療效，確定開始監測的最佳時間，分析肝癌、肝硬化的發生風險[8]。因此，對CHB患者進行肝纖維化評估至關重要。

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CER是血清中分離出的一種由肝臟合成的α2-糖蛋白，屬于急性期蛋白，在感染、炎癥和創傷期其血清水平會上升，機制是炎性細胞因子介導肝細胞基因轉錄[9]。本研究中，重度CHB患者和CHB后肝硬化進展為失代償患者血清CER水平顯著低于健康對照組；在CHB由輕度發展為重度，肝硬化從代償狀態轉變為失代償狀態的過程中，CER水平逐漸降低，這與Zeng等[9]、Yin等[10]的研究一致；ROC曲線分析顯示，CER診斷肝硬化的AUC為0.668，提示CER是判斷肝臟損害程度的良好指標。肝細胞受到HBV在其內復制帶來的免疫損傷后，分泌出的大量細胞因子會引起肝損害甚至肝衰竭，使CER的合成減少[11]。但本研究中，HBV陽性的HCC組患者CER水平升高，可能與HCC導致的CER核心鹽藻糖基化修飾有關[10]。

表2 CER、HA、FT3與肝纖維化診斷模型的相關性Tab.2 Correlation analysis of serum CER, HA and FT3 with the diagnostic model of the liver fibrosis

表3 CER、HA、FT3診斷肝硬化的可靠性分析Tab.3 Analysis of the reliability of CER, HA and FT3 for diagnosis of hepatic cirrhosis

圖1 CER(A)、HA(B)、FT3(C)及其聯合應用(D)診斷肝硬化的ROC曲線分析Fig.1 ROC curve of CER, HA, FT3 and combined detection on the diagnosis of liver cirrhosis

HA是肝細胞外基質的一種重要成分，主要由肝內儲脂細胞合成。當肝臟發生纖維化時，纖維細胞和間質細胞增生，導致HA合成增加。同時，肝臟受損又使其分解HA的能力下降，進一步升高了體內HA水平[12]。絕大多數肝病患者血清HA水平呈不同程度上升，尤其是在肝硬化患者中。本研究結果顯示，重度CHB組、肝硬化組HA水平高于對照組，差異有統計學意義(P＜0.01)，且HA與肝纖維化無創診斷模型指數具有中度相關性；HA檢測已發生肝硬化患者的AUC為0.826，有較好的診斷價值，提示HA是評價肝臟纖維化程度的良好指標。鑒于早期的肝纖維化是可逆的，而肝硬化是不可逆的[13]，因此，可通過對CHB患者進行HA檢測以監測其肝臟纖維化程度，從而早期發現、早期治療肝臟纖維化。

肝臟是眾多激素代謝的主要場所，CHB患者易并發甲狀腺疾病。轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)是最主要的促進纖維化的細胞因子，通過激活SMAD轉錄因子發揮作用[14]。而3,5,3,-三碘甲腺原氨酸(triiodothyronine，T3)可通過與核受體結合抑制TGF-β/SMAD通路轉錄激活，從而抑制纖維化的發生。CHB患者肝臟功能受損，代謝激素能力減弱，且肝臟纖維化導致合成代謝降低、分解代謝升高，進一步降低了甲狀腺激素水平，有學者指出肝纖維化患者甲狀腺激素水平越低，預后越差[15]。FT3是甲狀腺激素T3的活性部分，故血清FT3水平與肝臟纖維化有密切關系[16]。 本研究結果顯示，肝硬化組、HCC組FT3水平均低于對照組，差異有統計學意義，且血清FT3水平與肝纖維化無創診斷模型具有相關性。FT3診斷肝硬化的ROC曲線下面積為0.831，有較好的診斷價值。提示血清FT3水平也是評價肝臟纖維化及CHB患者預后的較好指標。

早期監測CHB患者肝臟纖維化及肝功能損害程度至關重要[17]。目前，肝纖維化診斷的金標準仍是肝臟活檢，但由于其具有侵入性、風險性和價格較高等特點，且肝臟標本選取位置及觀察視野的差異等也會導致最終結果出現偏差，故不能用于CHB患者肝纖維化程度的持續監控[18]。而血清學標本可重復、多次采集，并可實現持續監控。本研究證實血清CER、HA、FT3水平在CHB進展為肝硬化、HCC的過程中有提示作用，且與肝纖維化無創診斷模型相比，三者與肝纖維化水平均具有相關性，聯合診斷肝硬化的檢驗效能良好。