ERRα對(duì)hiPSCs衍生心肌細(xì)胞ATP合成的調(diào)控作用

周琴，張心愿，葉亮，許皓，謝敏，張穎，譚彬，易勤，田杰，朱靜

重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院兒科研究所/兒童發(fā)育疾病研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國(guó)家兒童健康與疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心(重慶)/兒童發(fā)育重大疾病國(guó)家國(guó)際科技合作基地/兒科學(xué)重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400014

心血管疾病是導(dǎo)致人類死亡的主要原因之一[1]。 由于心肌細(xì)胞不可再生，一旦心肌發(fā)生損傷將不可逆轉(zhuǎn)，因此，尋找可替代的細(xì)胞來(lái)源成為當(dāng)前的研究重點(diǎn)[2-3]。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)是2006年由Takahashi研究團(tuán)隊(duì)[4]利用基因編輯技術(shù)在小鼠成纖維細(xì)胞中導(dǎo)入4種關(guān)鍵干性因子[八聚體結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子3/4(octamer-binding transcription factor3/4，Oct-3/4)、性別決定區(qū)Y框蛋白2(sex determining region Y-box 2，SOX2)、細(xì)胞性骨髓細(xì)胞瘤癌基因(cellular-myelocytomatosis oncogene，c-MYC)、Krüppel樣因子4(Krüppel-like factor4，Klf4)]誘導(dǎo)而成的，具有自我更新、無(wú)限增殖及多向分化特性，同時(shí)又無(wú)免疫排斥及倫理學(xué)爭(zhēng)議等問(wèn)題[5]。因此，人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes，hiPSC-CMs)在心血管疾病的再生醫(yī)學(xué)、疾病模型、心臟毒理研究、藥物研發(fā)、心臟發(fā)育等方面具有廣闊的應(yīng)用前景[6-7]。近年來(lái)，盡管多能干細(xì)胞(PSCs)心肌分化的效率得到了顯著提升，但是目前對(duì)于分化過(guò)程中的代謝調(diào)控方式及其機(jī)制卻知之甚少。研究表明，PSCs主要利用有氧糖酵解供能并維持多能性狀態(tài)[8]，而分化的心肌細(xì)胞利用基于氧化磷酸化的有氧代謝來(lái)供能，表現(xiàn)為腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate，ATP)合成增加、線粒體膜電位升高、氧化磷酸化代謝相關(guān)基因表達(dá)增高等[9-10]。心肌細(xì)胞直接利用的能量形式為ATP，ATP供能對(duì)于心肌細(xì)胞的功能及活性至關(guān)重要。有研究發(fā)現(xiàn)，雌激素受體(estrogen-related receptor，ERR)亞家族(包含ERRα、ERRβ及ERRγ 3個(gè)成員)在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)中發(fā)揮了重要作用。其中，ERRα是心臟等高能量需求器官中通過(guò)控制組織生物能量來(lái)調(diào)節(jié)內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，在調(diào)控線粒體生物合成及氧化功能中具有重要作用[11-12]。但其在人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(hiPSCs)向hiPSCs-CMs分化前后的變化情況及調(diào)控ATP合成的機(jī)制卻未見(jiàn)報(bào)道。本研究分析hiPSCs向hiPSC-CMs分化前后ATP合成和ERRα及其下游靶基因的蛋白表達(dá)差異，初步探討ERRα對(duì)ATP合成的影響及其相關(guān)機(jī)制，為進(jìn)一步闡明PSCs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中的代謝調(diào)控機(jī)制提供支持。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑 未分化的hiPSCs細(xì)胞系、PGM1人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基及PSCs消化液購(gòu)自北京賽貝生物科技有限公司；基質(zhì)膠(Matrigel)購(gòu)自美國(guó)BD公司；無(wú)葡萄糖RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、含胰島素與不含胰島素的B27和腫瘤抗性抗原1-60(TRA-1-60)一抗購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司；糖原合成激酶3(glycogen synthase kinase-3，GSK-3)抑制劑CHIR99021和Wnt信號(hào)抑制劑IWP-2購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；RPMI 1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基與乳酸鈉購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；心肌肌鈣蛋白T2(TNNT2)、肌球蛋白重鏈6(MYH6)、GAPDH引物均合成于中國(guó)擎科生物科技有限公司；心肌肌鈣蛋白T(cTnT)、縫隙連接蛋白43(Cx43)、ERRα和細(xì)胞色素C(CytC)一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；SOX2一抗和HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司；階段特異性胚胎抗原4(SSEA4)、線粒體丙酮酸載體1(MPC1)一抗購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；XCT790購(gòu)自美國(guó)Med Chem Express公司；線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒和ATP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgGFITC和羊抗兔IgG-Cy3熒光二抗購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1hiPSCs的培養(yǎng)及心肌分化hiPSCs在Matrigel包被的平板上于無(wú)飼養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)條件下應(yīng)用PGM1人多能干細(xì)胞培養(yǎng)基維持培養(yǎng)(37 ℃，5%CO2)，至80%～95%融合后傳代。采用時(shí)序性短暫激活/抑制Wnt信號(hào)通路的方法將未分化的hiPSCs定向誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞。當(dāng)干細(xì)胞鋪板達(dá)到90%～100%融合時(shí)，更換培養(yǎng)基為無(wú)胰島素RPMI 1640+B27作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，首先添加GSK-3抑制劑CHIR99021(6 μmol/L)處理48 h，分化至第4天時(shí)采用Wnt通路阻滯劑IWP2(5 μmol/L)處理48 h。分化至第7天更換培養(yǎng)基為含胰島素RPMI 1640+B27的培養(yǎng)基。分化至第8天左右，即有細(xì)胞開(kāi)始跳動(dòng)。利用心肌細(xì)胞與非心肌細(xì)胞代謝方式的差異性，于分化第14天(此時(shí)絕大部分細(xì)胞可見(jiàn)明顯收縮活動(dòng))將培養(yǎng)基更換為含胰島素、4 mmol/L乳酸鈉的無(wú)葡萄糖RPMI 1640+B27培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d，此時(shí)培養(yǎng)基中的主要供能物質(zhì)為乳酸，而其他非心肌細(xì)胞則失去能量供應(yīng)而死亡。然后更換為含胰島素RPMI 1640+B27的培養(yǎng)基，于分化第18天左右，將心肌細(xì)胞消化成單細(xì)胞，再接種至新的平板中，然后應(yīng)用含胰島素RPMI 1640+B27培養(yǎng)基維持培養(yǎng)。hiPSCs心肌分化方案如圖1所示。

1.2.2免疫熒光染色 在未分化及分化第18天時(shí)進(jìn)行細(xì)胞爬片，并行免疫熒光染色，具體步驟如下:PBS洗3次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞20 min，PBS漂洗5 min×3次，然后加入0.5% Trixon-100透膜10 min，PBS漂洗，5%牛血清白蛋白室溫封閉30 min，加入待測(cè)抗體(SOX2、SSEA4A、TRA-1-60、cTnT和Cx43一抗，均為1:200稀釋)，4 ℃孵育過(guò)夜。37 ℃復(fù)溫30 min，PBS漂洗5 min×3次，避光分別加入羊抗小鼠IgG-FITC或羊抗兔IgG-Cy3熒光二抗(均為1:200稀釋)，37 ℃避光孵育1 h，PBS漂洗5 min×3次，最后DAPI(1:20)染色20 min，PBS漂洗5 min×3次，90%甘油封片，倒置熒光顯微鏡觀察hiPSCs中多能性標(biāo)志物SOX2、SSEA4A、TRA-1-60和分化第20天的hiPSC-CMs中心肌標(biāo)志物cTnT、Cx43表達(dá)情況，并拍照保存。

1.2.3RT-qPCR檢測(cè)TNNT2及MYH6 mRNA的表達(dá)水平 Trizol法提取hiPSCs與分化第20天的心肌細(xì)胞RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。以cDNA為模板、GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)心肌標(biāo)志物TNNT2及MYH6 mRNA的表達(dá)水平。PCR反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s，39個(gè)循環(huán)；65 ℃延伸5 s。結(jié)果以2-ΔΔCt法表示，取3次的平均值。引物序列見(jiàn)表1。

圖1 hiPSCs心肌分化方案Fig.1 Protocol of myocardial differentiation from hiPSCs

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.4Western blotting檢測(cè)ERRα、CytC及MPC1蛋白的表達(dá)水平 首先采用Western blotting檢測(cè)hiPSCs及分化第30天心肌細(xì)胞中的ERRα、CytC及MPC1蛋白水平。然后將分化第30天的心肌細(xì)胞分為4組:對(duì)照組(0 μmol/L)、5 μmol/L XCT790組、10 μmol/L XCT790組及15 μmol/L XCT790組，采用含相應(yīng)濃度的ERRα特異性抑制劑XCT790的培養(yǎng)基處理心肌細(xì)胞24 h，Western blotting檢測(cè)不同濃度XCT790對(duì)ERRα的抑制作用以篩選XCT790最佳工作濃度。最后將分化第30天的心肌細(xì)胞分為對(duì)照組及XCT790組，以XCT790最佳工作濃度處理72 h后檢測(cè)細(xì)胞中CytC及MPC1蛋白的表達(dá)水平。步驟如下:①各組細(xì)胞中加入適量的細(xì)胞裂解液冰浴裂解細(xì)胞，獲取蛋白后使用BCA法進(jìn)行蛋白濃度定量；②取等量蛋白(30 μg)進(jìn)行SDS-PAGE電泳分離，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h；③分別加入GAPDH、ERRα、MPC1及CytC抗體(1:1000)，放入4 ℃冰箱中孵育過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1 h，使用ECL顯影液進(jìn)行顯影；④采用Image Lab軟件對(duì)顯影條帶進(jìn)行灰度分析。

1.2.5ATP檢測(cè)試劑盒檢測(cè)胞內(nèi)ATP含量 檢測(cè)hiPSCs與分化第30天心肌細(xì)胞內(nèi)ATP的含量。同時(shí)將分化第30天的心肌細(xì)胞分為對(duì)照組及XCT790組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，XCT 7 9 0 組以篩選出的XCT790最佳工作濃度處理，72 h后檢測(cè)胞內(nèi)ATP含量。步驟如下:①按照1:9的比例用ATP檢測(cè)試劑稀釋液稀釋ATP檢測(cè)試劑，冰上保存；②吸除培養(yǎng)液，加入裂解液，細(xì)胞裂解后在4 ℃以12 000×g離心5 min，取上清，用于后續(xù)的測(cè)定；③加100 μl ATP檢測(cè)工作液到檢測(cè)孔內(nèi)，然后加入20 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，迅速用加樣槍混勻，至少間隔2 s后，采用化學(xué)發(fā)光儀測(cè)定化學(xué)發(fā)光值(RLU)；④根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出樣品中ATP的濃度，同時(shí)應(yīng)用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定樣品中的總蛋白濃度，把ATP的濃度換算成nmol/mg prot的形式。

1.2.6細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK-8)檢測(cè)不同濃度XCT790對(duì)hiPSC-CMs細(xì)胞活力的影響 將分化第30天的心肌細(xì)胞以3×103個(gè)/孔的密度接種于96孔板，待細(xì)胞貼壁恢復(fù)搏動(dòng)后分為4組:對(duì)照組(0 μmol/L)、5 μmol/L XCT790組、10 μmol/L XCT790組和15 μmol/L XCT790組，更換為含對(duì)應(yīng)濃度XCT790的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h。吸棄細(xì)胞上清，加入工作濃度的CCK-8檢測(cè)液，37 ℃避光孵育4 h后，在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)各孔吸光度(A)值。每組細(xì)胞活力(%)=(加藥孔A值－空白對(duì)照孔A值)/(細(xì)胞對(duì)照孔A值－空白對(duì)照孔A值)×100%。

1.2.7線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒檢測(cè)XCT790對(duì)hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響 將分化第30天的心肌細(xì)胞分為對(duì)照組與XCT790組，對(duì)照組常規(guī)培養(yǎng)，XCT790組以篩選出的XCT790最佳工作濃度處理，72 h后用PBS洗滌細(xì)胞1次，加入1 ml細(xì)胞培養(yǎng)液后加入1 ml JC-1染色工作液，充分混勻，細(xì)胞培養(yǎng)箱中37 ℃孵育20 min，用JC-1染色緩沖液洗滌2次，Hoechst染色10 min，PBS洗滌2次，加入2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液，激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍照。統(tǒng)計(jì)每組細(xì)胞紅綠熒光的比值，用紅綠熒光的相對(duì)比例來(lái)衡量線粒體膜電位的高低。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1hiPSCs形態(tài)觀察及鑒定 倒置顯微鏡下，hiPSCs呈集落生長(zhǎng)，集落邊緣光滑，細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞增殖較快，生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖2A)。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，hiPSCs表達(dá)干細(xì)胞多能性標(biāo)志物SOX2、SSEA4及TRA1-60(圖2B)。

圖2 hiPSCs形態(tài)觀察(A)及多能性鑒定(B)Fig.2 Observation of hiPSCs morphology (A) and identification of pluripotency (B)

2.2hiPSC-CMs形態(tài)觀察及鑒定 消化成單細(xì)胞的hiPSC-CMs再接種后約48 h恢復(fù)跳動(dòng)，與hiPSCs相比，hiPSC-CMs無(wú)增殖能力，形態(tài)發(fā)生較大變化:細(xì)胞體積增大，核質(zhì)比降低，細(xì)胞呈梭形(圖3A)。RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與hiPSCs相比，分化第20天的hiPSC-CMs心肌標(biāo)志物TNNT2(82.820±2.005 vs. 1.001±0.029)及MYH6(90 982.000±1 968.000 vs. 1.003±0.053)mRNA相對(duì)表達(dá)量明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為40.790、46.230，P＜0.001)。免疫熒光結(jié)果顯示，分化第20天的hiPSC-CMs表達(dá)心肌標(biāo)志物cTnT及Cx43(圖3B)。

圖3 hiPSC-CMs形態(tài)觀察及鑒定Fig.3 Morphological observation and identification of hiPSC-CMs

2.3心肌分化前后胞內(nèi)ATP含量、ERRα及其下游蛋白的表達(dá)情況 與hiPSCs相比，分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖4，表2)。

圖4 hiPSCs(D0)與分化第30天的hiPSC-CMs中ERRα、CytC及MPC1蛋白表達(dá)情況Fig.4 Expressions of ERRα, CytC and MPC1 protein in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation

2.4XCT790最佳工作濃度篩選 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，5、10、15 μmol/LXCT790組的ERRα蛋白表達(dá)降低，且呈濃度依賴性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖5A)。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，15 μmol/L XCT790能明顯抑制hiPSC-CMs細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，而5、10 μmol/L XCT790組與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05，圖5B)。因此選擇10 μmol/L作為XCT790的最佳工作濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.5抑制ERRα對(duì)hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量的影響 應(yīng)用10 μmol/L XCT790處理hiPSC-CMs 72 h后，胞內(nèi)ATP含量為(4.903±1.158) nmol/mg prot，低于對(duì)照組的(9.310±0.980) nmol/mg prot，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.904，P＜0.05)。

2.6抑制ERRα對(duì)hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響 JC-1染色結(jié)果顯示，10 μmol/L XCT790組的紅綠熒光比值明顯低于對(duì)照組(1.407±0.022 vs. 1.977±0.093)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=5.959，P＜0.05，圖6)。

表2 hiPSCs與分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達(dá)變化(±s，n=3)Tab.2 Changes of intracellular ATP content and protein expressions of ERRα, CytC and MPC1 in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation (±s, n=3)

表2 hiPSCs與分化第30天的hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量及ERRα、CytC、MPC1蛋白表達(dá)變化(±s，n=3)Tab.2 Changes of intracellular ATP content and protein expressions of ERRα, CytC and MPC1 in hiPSCs and hiPSC-CMs on day 30 of differentiation (±s, n=3)

D0. hiPSCs；D30. 分化第30天hiPSC-CMs；ERRα. 雌激素相關(guān)受體α；CytC. 細(xì)胞色素C；MPC1. 線粒體丙酮酸載體1

2.7抑制ERRα對(duì)hiPSC-CMs中CytC、MPC1蛋白表達(dá)的影響 用10 μmol/L XCT790處理hiPSCCMs 72 h后，其CytC和MPC1蛋白表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組(分別為0.705±0.019 vs. 0.897±0.011、0.594±0.021 vs. 0.797±0.025)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t分別為8.794、6.206，P＜0.01，圖7)。

圖5 不同濃度XCT790對(duì)ERRα蛋白表達(dá)(A)及細(xì)胞活性(B)的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of XCT790 with different concentrations on ERRα protein expression (A) and cell activity (B)

圖6 XCT790抑制ERRα對(duì)hiPSC-CMs線粒體膜電位的影響(JC-1染色)Fig.6 XCT790 inhibits the effect of ERRα on the mitochondrial membrane potential of hiPSC-CMs (JC-1 staining)

圖7 XCT790抑制ERRα對(duì)CytC和MPC1蛋白表達(dá)的影響Fig.7 XCT790 inhibits the effect of ERRα on the protein expressions of CytC and MPC1

3 討 論

心肌細(xì)胞屬于不可再生細(xì)胞，在心肌梗死心肌細(xì)胞受到不可逆損傷而缺乏修復(fù)手段時(shí)，最終可能發(fā)展為心力衰竭。近期發(fā)現(xiàn)，在非人類靈長(zhǎng)動(dòng)物模型中，多能干細(xì)胞衍生心肌細(xì)胞(PSCCMs)能有效改善梗死心臟的結(jié)構(gòu)及功能[13-14]， 充分證明了PSC-CMs的潛在價(jià)值。盡管近年來(lái)心肌分化效率及應(yīng)用方面取得了可喜成果，但是傳統(tǒng)培養(yǎng)方法誘導(dǎo)的hPSC-CMs仍存在代謝不成熟的問(wèn)題，限制了其應(yīng)用[15-17]。

現(xiàn)有研究初步證實(shí)，干細(xì)胞分化過(guò)程伴隨著線粒體重塑及代謝重塑[18-19]，PSCs維持較高的糖酵解率，分化為心肌細(xì)胞后糖酵解率降低，氧化磷酸化水平升高[20-22]。心臟是線粒體最富集的器官之一，線粒體約占心臟容量的30%，心臟中合成的ATP超過(guò)95%來(lái)源于線粒體氧化磷酸化，ATP的合成直接反映了心肌細(xì)胞的代謝狀態(tài)[23]。線粒體膜電位是反映細(xì)胞內(nèi)線粒體功能狀態(tài)的重要參數(shù)之一，正常的線粒體膜電位是維持線粒體進(jìn)行氧化磷酸化、產(chǎn)生ATP的先決條件，線粒體膜電位下降會(huì)抑制氧化磷酸化反應(yīng)，進(jìn)而引發(fā)ATP合成受阻。ERRα是線粒體功能及生物發(fā)生相關(guān)基因的關(guān)鍵核調(diào)節(jié)因子之一，通過(guò)調(diào)控其下游代謝基因的表達(dá)調(diào)控能量代謝[12,24]。有研究發(fā)現(xiàn)，ERRα可促進(jìn)心臟線粒體氧化磷酸化、脂肪酸β氧化及線粒體生物合成等代謝過(guò)程[25]，ERRα基因敲除小鼠在心臟壓力超負(fù)荷時(shí)表現(xiàn)出心室擴(kuò)張、最大ATP合成速率降低等心力衰竭特征[26]，提示ERRα在調(diào)控心臟代謝及功能中具有重要作用。hiPSCCMs與原代心肌不完全相同，ERRα在hiPSC-CMs中調(diào)控ATP合成的作用尚未見(jiàn)報(bào)道。MPC1定位于線粒體內(nèi)膜，主要功能是將丙酮酸從線粒體外運(yùn)輸?shù)骄€粒體內(nèi)，然后進(jìn)入三羧酸循環(huán)合成ATP[27-28]。 線粒體電子傳遞鏈(ETC)作為氧化磷酸化過(guò)程的一部分，消耗氧氣以產(chǎn)生ATP，而CytC是ETC上重要的電子傳遞體，是有氧化代謝的核心。當(dāng)CytC缺乏時(shí)，呼吸鏈上的電子傳遞被阻斷，ATP合成直接受到抑制。研究證實(shí)，ERRα作為轉(zhuǎn)錄因子可靶向MPC1與CytC基因的啟動(dòng)子，直接調(diào)控其轉(zhuǎn)錄過(guò)程[11,29-30]。

部分分化的hiPSCs將影響心肌分化的效率，免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示hiPSCs表達(dá)多能性標(biāo)志物，說(shuō)明hiPSCs具有多能性且處于未分化狀態(tài)，可用于后續(xù)的心肌誘導(dǎo)分化。本研究采用小分子化合物CHIR與IWP2時(shí)序性短暫激活/抑制Wnt信號(hào)通路的方法誘導(dǎo)hiPSCs心肌分化[31-32]，RT-qPCR與免疫熒光結(jié)果均證實(shí)成功誘導(dǎo)hiPSCs分化為表達(dá)心肌特異性標(biāo)志物的心肌細(xì)胞。當(dāng)hiPSCs分化為hiPSC-CMs后ATP合成明顯增加，這與其高氧化磷酸化狀態(tài)相符。細(xì)胞功能的改變往往伴隨蛋白表達(dá)的變化。本研究發(fā)現(xiàn)，hiPSCs在分化為心肌細(xì)胞后ERRα、CytC及MPC1蛋白表達(dá)均明顯升高，與胞內(nèi)ATP含量呈正相關(guān)。因此，筆者推測(cè)在hiPSCs分化為hiPSC-CMs后，ATP合成增多是由ERRα表達(dá)增高引起，ERRα在調(diào)控ATP合成中扮演重要角色。為了進(jìn)一步探明ERRα在ATP合成中的作用，本研究選用10 μmol/L的ERRα特異性抑制劑XCT790抑制hiPSC-CMs中ERRα的蛋白活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，ERRα受抑制后，hiPSC-CMs胞內(nèi)ATP含量與線粒體膜電位均降低，證實(shí)hiPSC-CMs胞內(nèi)高水平的ATP含量與ERRα表達(dá)增高有關(guān)，ERRα能夠通過(guò)影響線粒體膜電位參與調(diào)控hiPSC-CMs中ATP的合成。本研究還發(fā)現(xiàn)，ERRα受抑制后MPC1及CytC表達(dá)均降低，說(shuō)明在hiPSC-CMs中ERRα可能通過(guò)調(diào)控MPC1及CytC的表達(dá)而影響ATP的合成。

綜上所述，本研究初步證實(shí)了ERRα在hiPSC分化為hiPSC-CMs及其ATP合成的調(diào)控中具有重要作用，可能的機(jī)制是通過(guò)調(diào)控線粒體膜電位及CytC、MPC1等下游靶蛋白的表達(dá)而影響ATP的合成，提示可通過(guò)促進(jìn)hiPSC-CMs中ERRα的表達(dá)增強(qiáng)hiPSCCMs的氧化代謝，進(jìn)而促進(jìn)其代謝成熟，為將來(lái)hiPSC-CMs更好地應(yīng)用于臨床奠定了基礎(chǔ)，但仍需后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)。此外，hiPSCs向心肌細(xì)胞分化過(guò)程中伴隨的代謝變化及調(diào)控機(jī)制極其復(fù)雜，也需更多的研究進(jìn)一步闡明。