肝癌肝移植術后復發患者CD4+ T淋巴細胞ATP含量與亞群計數檢測的臨床意義

董家勇，滕飛，郭聞淵，施曉敏，傅志仁，丁國善，楊璟輝

海軍軍醫大學第二附屬醫院器官移植科，上海 200003

原發性肝癌(肝癌)是臨床常見的惡性腫瘤之一，其病死率居全球癌癥的第2位[1]。目前手術切除肝癌腫瘤組織和肝移植是治療肝癌的主要方法[2]， 前者術后5年生存率普遍較低，而后者是一種較理想的療法，可根治性切除腫瘤，使肝臟的微環境和功能完全恢復，若受者選擇適當，術后5年生存率高達65%～80%[3]。有研究發現，肝癌肝移植術后過度服用免疫抑制劑會促進腫瘤復發，降低療效[4]。 相比之下，維持最低有效免疫抑制濃度既可有效抑制排斥的發生，又可延緩腫瘤復發及進展。因此，如何維持最低有效免疫抑制濃度已成為各肝移植中心亟待解決的問題。近年來，臨床上采用ImmuKnowTM免疫細胞功能測定試劑盒檢測外周血CD4+T淋巴細胞的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphophate，ATP)含量，IOTest試劑盒檢測其亞群計數，以評估受體細胞介導的免疫反應(cellmediated immunity，CMI)狀態[5]。多個臨床試驗結果顯示，CD4+T淋巴細胞的ATP含量和亞群計數與移植術后的機體免疫狀態明顯相關，可作為評估器官移植術后免疫狀態的參考指標[6-7]。本研究通過測定肝癌肝移植術后患者CD4+T淋巴細胞ATP含量和亞群計數，評估患者免疫狀態的變化，為制定個體化、精準化的免疫抑制治療方案提供理論依據。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2015年11月－2018年11月于上海長征醫院因原發性肝癌行經典原位肝移植術的84例患者，所有入組患者均符合肝癌肝移植受體選擇的“杭州標準”；器官供體、受體的ABO血型相同。根據腫瘤是否復發將患者分為復發組(n=42)與未復發組(n=42)。復發組:男38例，女4例；年齡35～66歲；復發部位包括肝內(24例)、肺(11例)、椎體(3例)、肝門部淋巴結(2例)、右腎上腺(1例)及心包旁淋巴結(1例)。未復發組:男37例，女5例；年齡33～65歲。本研究經長征醫院倫理委員會批準，所有患者均簽署知情同意書。

1.2術后免疫抑制治療方案 所有患者術后免疫抑制治療方案均采用經典三聯療法，即他克莫司(tacrolimus，FK506)+麥考酚嗎乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)+甲潑尼龍。其中FK506劑量為0.05～0.10 mg/kg，每12 h口服1次，終身維持服用；MMF于術后1周開始口服，0.5 g/12 h，3個月后停用；甲潑尼龍用法為第1周靜脈滴注，術中無肝期1000 mg，術后第1天240 mg，以后40 mg/d逐漸減量，直至術后第7天改為口服甲潑尼龍片劑20 mg，維持1個月后停用。

1.3CD4+T淋巴細胞內ATP含量及亞群計數 在排除感染和免疫排斥的情況下采集全血標本，采集時間為確診復發當日[術后(13.7±5.4)個月]，復發后第1、3、6個月；未復發患者全血標本以與復發患者確診復發當日相同術后時間為起點，之后1、3、6個月進行采集。采集后6 h內完成細胞刺激培養，并于次日按照ImmuKnowTM免疫細胞功能測定試劑盒步驟檢測CD4+T淋巴細胞ATP含量，按照IOTest試劑盒(日本BECKMAN-COULTER流式細胞儀)說明書步驟檢測其亞群計數。

1.4統計學處理 采用SPSS 24.0和Graphpad Prism 8軟件進行統計分析。計量資料以±s表示。組間及組內比較采用分層重復測量數據的方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。在進行分層重復測量數據的方差分析時，先進行Mauchly's球對稱檢測，若P＜0.05，則采用Greenhouse-Geisser自由度校正結果。

2 結 果

2.1兩組CD4+T淋巴細胞ATP含量比較 Mauchly's球對稱檢測結果顯示，CD4+T淋巴細胞ATP含量不隨腫瘤復發時間的延長而發生變化(時間與時間及組別的交互項P值分別為0.824、0.647)。組間比較顯示，復發后第1、3、6個月，復發組患者CD4+T淋巴細胞ATP含量均明顯低于未復發組(P＜0.05， 圖1)。

圖1 兩組肝癌肝移植術后患者CD4+ T淋巴細胞ATP含量比較(n=42)Fig.1 Comparison of ATP contents in CD4+ T lymphocytes between the two groups of patients with liver cancer after liver transplantation

2.2兩組CD4+T淋巴細胞亞群計數比較 Mauchly's球對稱檢測結果顯示，CD4+T淋巴細胞亞群計數隨復發時間延長而降低，兩組間差異有統計學意義(時間與時間及組別的交互項P值均＜0.05)。組間比較顯示，與未復發組比較，復發組患者CD4+T淋巴細胞亞群計數在復發后第1個月內基本維持穩定，復發后第3～6個月呈明顯下降趨勢(P＜0.05，圖2)。

圖2 兩組患者CD4+ T淋巴細胞亞群計數比較(n=42)Fig.2 Comparison of subgroup count of CD4+ T lymphocytes between the two groups of patients with liver cancer after liver transplantation

3 討 論

腫瘤復發會影響肝移植患者的長期生存，其病理演變過程較復雜，涉及多環節、多系統、多階段、多通路等。有研究發現，促進肝移植術后腫瘤復發或復發后加速惡化的影響因素較多，按移植手術階段不同包括:移植前的肝癌腫瘤組織侵犯了肝內脈管系統、淋巴組織等；移植手術期間腫瘤組織殘留在體內；移植后長期過度免疫抑制加速微轉移灶的生長等。已有研究表明，過度免疫抑制為可調節因素，可影響肝癌肝移植術后腫瘤復發或復發后加速其進展[8]。肝癌肝移植術后的抗腫瘤過程主要由細胞免疫反應介導，其中CD4+T淋巴細胞是機體CMI的啟動細胞。目前臨床上常用的鈣調磷酸酶抑制劑以CD4+T淋巴細胞為靶細胞，能夠抑制線粒體呼吸鏈，致使其ATP含量和亞群計數降低[9]。肝癌肝移植患者受到持續免疫抑制，其機體抗腫瘤能力下降，腫瘤易復發[10]。因此，定量監測術后CD4+T淋巴細胞的ATP含量和亞群計數可量化評估受者免疫功能狀態，在不發生排斥反應的情況下，調整免疫抑制劑用量，盡可能維持較低的免疫抑制劑濃度，對控制和延緩腫瘤復發具有重要意義。

T淋巴細胞介導的細胞免疫應答的前提是CD4+T淋巴細胞活化[11]。有研究表明，可通過檢測外周血CD4+T淋巴細胞的免疫功能間接反映受檢者的CMI狀態[12]。盡管外周血CD4+T淋巴細胞的免疫功能在不同個體之間差異較大，但在健康及移植后免疫狀態穩定的個體中，CD4+T淋巴細胞的ATP含量和亞群計數相對穩定。當移植受者因持續免疫抑制導致CMI降低時，其外周血CD4+T淋巴細胞的ATP含量和亞群計數均明顯降低[13-14]。2016年Zhang等[5]采用ImmuKnowTM法檢測76例肝癌肝移植術后患者CD4+T淋巴細胞ATP含量，結果顯示，健康人與免疫狀態穩定的受者ATP含量均＞300 ng/ml，而腫瘤復發受者的ATP含量為190 ng/ml。

已有研究發現，肝癌肝移植術后腫瘤復發患者應用免疫抑制劑可在一定程度上抑制機體內細胞免疫系統，導致患者抗腫瘤能力進一步降低，因此，術后應用免疫抑制劑是促進腫瘤復發后進展加速的重要因素之一[15-16]。Lerut等[17]分析了引起肝癌肝移植術后腫瘤復發的各種因素，發現術后免疫抑制劑的用量是影響腫瘤復發的獨立因素。Piros等[18]定量分析肝癌肝移植后復發的影響因素發現，低劑量的免疫抑制劑可抑制復發腫瘤細胞的快速進展。上述研究結果表明，術后免疫抑制劑的用量與腫瘤復發或復發后加速進展存在一定關聯，理論上免疫狀態的評估可指導免疫抑制劑的用量，為肝癌肝移植術后腫瘤復發患者制定個體化、精準化的免疫抑制劑方案提供依據。

目前，利用肝癌肝移植術后復發患者外周血CD4+T淋巴細胞ATP含量和亞群計數評估免疫狀態的研究較少。本研究納入的研究對象(排除感染和排異患者)均處于免疫抑制相對穩定的狀態，其CD4+T淋巴細胞ATP含量和亞群計數均低于健康人群。本課題組的前期研究發現，CD4+T淋巴細胞的亞群計數與ATP含量之間無明顯的線性相關，兩者是相對獨立的[19]。本研究結果顯示，與肝癌肝移植術后未復發患者相比，復發患者的CD4+T淋巴細胞ATP含量在確診復發后6個月內的不同時期均明顯降低，原因可能為CD4+T淋巴細胞ATP含量的變化早于腫瘤復發，即當患者確診腫瘤復發時，CD4+T淋巴細胞ATP含量已經下降至較低水平。肝癌肝移植術后復發3個月后，可通過檢測CD4+T淋巴細胞亞群計數來有效判斷復發的免疫狀態，指導調節免疫抑制劑用量。對于肝癌肝移植術后復發患者的免疫抑制劑用量，可通過監測外周血CD4+T淋巴細胞ATP含量和亞群計數來及時調整并維持最低有效濃度，可能有助于延緩腫瘤復發。因此，筆者認為通過外周血CD4+T淋巴細胞ATP含量和亞群計數為肝癌肝移植患者擬定個體化治療方案具有重要的臨床意義。

雖然本研究結果顯示，通過外周血CD4+T淋巴細胞ATP含量來評估肝癌肝移植術后復發早期的免疫狀態更為敏感，但移植后腫瘤復發患者的免疫狀態是變化的，并非維持穩定狀態，其隨腫瘤復發后的治療及腫瘤的不斷進展呈現逐漸下調趨勢，因此在積極抗腫瘤治療的同時，可早期減少免疫抑制劑用量，維持最低有效濃度，以提高機體抗腫瘤能力。本研究為單中心、小樣本研究，未來需要開展前瞻性、多中心、大樣本研究進一步證實肝癌肝移植術后復發患者能否使用免疫增強劑(如胸腺肽等)進行聯合治療。