皮膚駐留調節性T細胞在燒傷創面愈合中的作用

信躍文，董寧，吳瑤，柴艷芬*，姚詠明*

1天津醫科大學總醫院急診醫學科，天津 300052；2解放軍總醫院第四醫學中心創傷研究中心，北京 100048

燒傷后皮膚局部的炎癥反應對創面愈合及預后具有重要的調節作用[1]。傷口愈合過程一般包括炎癥反應、組織再生及重塑期三個階段[2]。研究證實，調節性T細胞(regulatory T cells，Tregs)穩定存在于哺乳動物和人類外周非淋巴組織中并參與維持免疫耐受平衡[3-4]，其中皮膚駐留Tregs參與傷口愈合過程的炎癥反應階段，并可能與全層皮膚損傷后創面愈合相關[5-6]。本研究觀察了局部耗竭Tregs對燒傷創面愈合的動態影響，并探討其潛在的作用及 意義。

1 材料與方法

1.1主要試劑及儀器 白喉毒素(diphtheria toxin，DT，美國List Biological Laboratories公司)；FITC抗小鼠CD4單克隆抗體、PE抗小鼠CD25單克隆抗體(美國Biolegend公司)；APC抗小鼠CD152(CTLA-4)單克隆抗體(美國eBioscience公司)；膠原酶Ⅺ型(美國Sigma公司)；中性蛋白酶Ⅱ型(瑞士Celln Tec公司)。FACS Calibur流式細胞分析儀(美國BD 公司)。

1.2實驗動物及分組 C57BL/6J野生型(WT)雄性小鼠60只，6～8周齡，購自北京華阜康生物科技股份有限公司。叉頭翼狀螺旋轉錄因子p3(forkhead/winged helix transcription factor p3，Foxp3)DTR型轉基因小鼠[C57BL/6J-Tlreml(flox)somc]60只，8～15周齡，購自上海南方模式生物科技股份有限公司。實驗前讓小鼠充分適應環境1周，自由進食進水。設置Foxp3DTR型-白喉毒素注射組(F-DT組，n=18)和野生型-白喉毒素注射組(C-DT組，n=18)，組內依據隨機數字表法分別分為早期組(n=9)與晚期組(n=9)。

1.3燒傷模型制備 小鼠腹腔注射5%水合氯醛(6～8 ml/kg)麻醉，備皮，俯臥位充分暴露背部皮膚，固定四肢。用黃銅探針(直徑8 mm)誘導小鼠背部皮膚全層接觸燒傷，溫度設置為300 ℃，接觸皮膚2～3 s，制備小鼠燒傷模型，經組織學證明為全層損傷[7-8]。腹腔注射0.9%氯化鈉注射液進行液體復蘇，觀察小鼠復蘇情況，24～48 h持續觀察小鼠生命體征。每組小鼠單獨圈養，自由進食進水。每日檢查傷口情況，避免感染與鼠群撕咬增加額外 創傷。

1.4體內Tregs階段性誘導性耗竭 在不影響燒傷小鼠存活的前提下，F-DT組與C-DT組小鼠腹腔注射10 ng/g DT[7,9]。為了達到在燒傷愈合早期耗竭Tregs的目的，分別于傷前1天(D-1)、傷后第0天(D0)、第3天(D3)對F-DT早期組和C-DT早期組小鼠腹腔注射10 ng/g DT[6]；為耗竭晚期愈合過程中的Tregs，分別于燒傷后第5天(D5)、第7天(D7)和第9天(D9)對F-DT晚期組和C-DT晚期組小鼠腹腔注射10 ng/g DT。實驗重復3次。

1.5傷口測量與組織形態學分析 從致傷后開始，分別于D0、D3、D5、D7、D9、D11對小鼠背部創面進行拍照，通過ImageJ軟件(NIH，Bethesda，MD)應用數字化傷口照片測量不同時間點傷口面積以評估傷口愈合率。每張圖片中的度量標尺均設置測量標準。各組部分小鼠于傷后第7天處死，取傷口及周圍1～2 cm皮膚，用生理鹽水沖洗干凈，75%乙醇浸泡消毒后，4%甲醛固定，包埋，切片，蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察表皮層及真皮層組織病理學變化。

1.6流式細胞學分析 采用酶消化法消化真皮組織得到細胞懸液，用于流式細胞儀分析傷口愈合期間Tregs局部浸潤及功能表型的變化。剪取傷口周圍1～2 cm皮膚，用生理鹽水反復沖洗或70%乙醇消毒，去除皮下脂肪及結締組織。再用0.2%中性蛋白酶Ⅱ于4 ℃浸泡消化過夜。隔夜取出皮膚組織，剝離表皮，將真皮組織剪碎，用2 mg/ml膠原酶Ⅺ于37 ℃恒溫搖床消化30～50 min，觀察消化效果。真皮細胞懸液經過濾、漂洗、計數后分裝，分別加入抗小鼠CD4抗體、抗小鼠CD25抗體、抗小鼠CTLA-4抗體、抗小鼠可誘導性共刺激分子(inducible costimulator，ICOS)抗體并于破膜后加入抗小鼠Foxp3抗體。避光孵育，采用流式細胞儀檢測Tregs局部浸潤及表面分子[10]的表達變化。以CD4+Foxp3+作為皮膚Tregs的基礎表型[11]。

1.7統計學處理 采用SPSS 19.0軟件進行統計分析。計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，進一步兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1DT對燒傷愈合過程中皮膚局部Tregs浸潤的影響 流式細胞儀檢測結果顯示，早期Tregs誘導耗竭第3天，F-DT組小鼠皮膚局部組織Tregs浸潤與第0天比較明顯減少，且F-DT組少于C-DT組(P＜0.05)。晚期Tregs誘導耗竭第7天，F-DT組小鼠皮膚局部組織Tregs浸潤與第0天比較明顯減少，且F-DT組少于C-DT組(P＜0.05，表1)。

2.2體內Tregs耗竭對燒傷創面愈合的影響 早期注射DT期間，F-DT組小鼠燒傷創面愈合率與C-DT組比較明顯降低，主要表現為第7～11天傷口愈合減慢，愈合曲線坡度變緩(P＜0.05，圖1A)；晚期注射DT期間，兩組燒傷創面愈合率差異無統計學意義(P＞0.05，圖1B)。

表1 兩組小鼠皮膚Tregs浸潤情況 (±s，n=6)Tab.1 The infiltration of skin Tregs in two groups of mice (±s, n=6)

表1 兩組小鼠皮膚Tregs浸潤情況 (±s，n=6)Tab.1 The infiltration of skin Tregs in two groups of mice (±s, n=6)

與D0比較，(1)P＜0.05；與C-DT組比較，(2)P＜0.05。

圖1 DT注射期間兩組小鼠皮膚創面愈合情況及愈合率比較Fig.1 Comparison of skin wound healing and healing rate curve of two groups of mice during DT injection

2.3小鼠皮膚燒傷后愈合情況 HE染色結果顯示，燒傷后第7天，C-DT組小鼠皮膚可見明顯結痂，血管生成明顯，再上皮化進程迅速；與C-DT組相比，F-DT早期組小鼠皮膚肉芽組織增生明顯，無明顯結痂及瘢痕生成，血管生成不明顯，再上皮化進程緩慢；與C-DT組及F-DT早期組相比，F-DT晚期組小鼠皮膚可見明顯結痂及瘢痕組織，血管生成明顯，再上皮化進程與C-DT組相似，但略慢于C-DT組(圖2)。

2.4燒傷后WT小鼠皮膚Tregs浸潤及表型變化 流式細胞儀檢測結果顯示，WT小鼠皮膚CD4+Foxp3+T細胞浸潤在燒傷后即明顯增加，以第5天最為顯著(表2)，其后則逐漸降低，第11天降至基礎水平。小鼠皮膚CD25+Tregs在燒傷后即明顯增加，于第3天達峰值，然后逐漸下降。小鼠皮膚Tregs CTLA-4表達水平在燒傷后即明顯增高，第3天達峰值，然后逐漸降低(表2)。同樣，Tregs ICOS表達水平在燒傷后即明顯增高，第5天達峰值，然后逐漸降低，第11天降至基礎水平(表2)。

圖2 兩組小鼠皮膚燒傷后愈合情況(HE ×4)Fig.2 Healing after skin burns in two groups of mice

表2 燒傷后不同時間WT小鼠皮膚Tregs的局部浸潤及功能表型變化 (%，±s，n=6)Tab.2 Local infiltration and phenotypic changes of skin Tregs in WT mice after burn injury (%,±s, n=6)

表2 燒傷后不同時間WT小鼠皮膚Tregs的局部浸潤及功能表型變化 (%，±s，n=6)Tab.2 Local infiltration and phenotypic changes of skin Tregs in WT mice after burn injury (%,±s, n=6)

與D0比較，(1)P＜0.05。

3 討 論

本研究首先對Foxp3DTR型小鼠注射DT，特異性、階段性地抑制Tregs的表型及功能。Foxp3DTR型小鼠DT受體基因的表達受Foxp3啟動子調控，因此在注射DT期間會引起Tregs耗竭[6,9]。傳統的選擇性抑制細胞功能分子表達的方法多用于蛋白轉錄及免疫酶學研究領域[12-13]，有學者運用該方法選擇性耗竭Tregs以觀察其對小鼠全層皮膚損傷后愈合過程的影響，初步觀察到Tregs耗竭可減慢皮膚再上皮化進程[6]，但該方法用于體內實驗存在明顯缺陷。

據報道，采用50 ng/g DT注射Foxp3DTR型小鼠48 h之內僅4%的CD4+T細胞表達Foxp3+，表明這種方法可引起小鼠體內96%的Tregs耗竭[9]。本研究在充分保證燒傷后Foxp3DTR型小鼠存活的條件下，給予腹腔注射10 ng/g DT，發現在燒傷早期及晚期，該劑量DT作用下F-DT組小鼠皮膚Tregs耗竭達C-DT組的80%以上。進一步分析皮膚Tregs對燒傷創面愈合率的影響，觀察到燒傷愈合早期(前5 d)耗竭小鼠皮膚Tregs可使第5～11天創面愈合明顯減慢；而在燒傷愈合晚期(第7～11天)耗竭小鼠皮膚Tregs對創面愈合率的影響不明顯，表明皮膚Tregs在燒傷早期參與了創面愈合的過程，這一結果與創面組織HE染色及組織病理學變化一致。分析燒傷后炎癥反應階段對皮膚Tregs功能表型的影響，發現野生型小鼠皮膚Tregs浸潤在傷后第3～5天明顯增加，第5天達峰值，然后逐漸減少；CTLA-4和ICOS功能分子表達水平在燒傷后第3天最高。已知CTLA-4是T細胞膜表面重要的共抑制分子，在外周T細胞免疫耐受中發揮著重要作用，可用來反映Tregs的功能活性；ICOS是新近發現的在T細胞活化中起關鍵作用的共刺激分子，在T細胞亞群構成變化及功能表達方面具有重要意義[14]。因此，結合組織病理學變化，本研究結果表明皮膚Tregs在燒傷早期作用于創面局部組織，可增強免疫調節效應，促進創面愈合過程。

綜上所述，皮膚中駐留的Tregs對燒傷創面愈合過程具有積極的促進作用。本研究通過體內實驗初步明確了燒傷后皮膚Tregs的免疫活性及功能特點，為臨床應用提供了新線索，如通過誘導劑促進Tregs的功能表達，從而加速燒傷創面愈合值得進一步研究[15-16]。此外，創傷修復一直是再生醫學及軍事醫學研究的重要領域[17]，各種組織修復替代材料應用于創面局部發揮其免疫效應以促進組織修復日益受到關注[18-20]。因此，通過組織替代材料的免疫原性調控皮膚Tregs狀態進而影響創面修復過程，值得深入探討。