法舒地爾對(duì)變應(yīng)性鼻炎小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg相關(guān)細(xì)胞因子的影響

張玉，韓佳利

（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，沈陽(yáng) 110001）

變應(yīng)性鼻炎（allergic rhinitis，AR）是常見(jiàn)的上呼吸道慢性炎癥［1］，常由環(huán)境抗原（塵螨、植物花粉和動(dòng)物蛋白等）刺激導(dǎo)致，是以輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th ）2細(xì)胞因子優(yōu)勢(shì)表達(dá)、IgE 過(guò)度合成、嗜酸性粒細(xì)胞選擇性浸潤(rùn)為特征的疾病。Th1/Th2［2］、Th17/調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory T cell，Treg）［3］的免疫失衡是目前已知的變應(yīng)性鼻炎發(fā)病的重要機(jī)制。Th1、Th2、Th17、Treg 均屬于 CD4+T 細(xì)胞。干擾素γ（interferon γ，IFN-γ）、白細(xì)胞介素4（interlukin-4，IL-4）、IL-17、Foxp3 分別是 Th1、Th2、Th17、Treg 的主要效應(yīng)因子［4］。AR研究已有數(shù)個(gè)世紀(jì)的歷史，對(duì)其癥狀的控制越來(lái)越成熟，但徹底治愈AR仍是耳鼻咽喉科的難點(diǎn)問(wèn)題。AR的發(fā)病機(jī)制、免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)體系和治療方案仍在不斷探索中。法舒地爾是Rho激酶抑制劑。已有研究［5-6］表明Rho激酶通過(guò)介導(dǎo)氣道平滑肌收縮［7］、炎癥細(xì)胞遷移［8］在哮喘［9］、AR［10］等慢性氣道炎癥疾病的發(fā)生過(guò)程中起重要作用［11］。Rho激酶抑制劑可有效抑制和逆轉(zhuǎn)氣道高反應(yīng)性和氣道重建，減輕變應(yīng)性氣道炎癥和黏液分泌［12］。

本研究建立AR小鼠模型，選用鹽酸法舒地爾作為治療藥物，觀察小鼠鼻黏膜局部炎癥反應(yīng)，檢測(cè)小鼠鼻黏膜中Th1/Th2、Th17/Treg分泌的代表性細(xì)胞因子 IFN-γ/IL-4、IF-17/Foxp3的mRNA表達(dá)情況，旨在探討法舒地爾在AR中的作用及產(chǎn)生的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、試劑及分組

6～8周齡C57小鼠24只（中國(guó)醫(yī)科大學(xué)藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供），雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g；試劑主要包括卵清蛋白（ovalbumin，OVA，美國(guó)Sigma公司）、AL（OH）3、鹽酸法舒地爾（天津紅日藥業(yè)股份有限公司）。將小鼠隨機(jī)分為AR組（AR小鼠未給予藥物治療，n=8）、法舒地爾組（AR小鼠給予法舒地爾治療，n=8）、對(duì)照組（正常小鼠，n=8）。

1.2 AR小鼠模型建立

1.2.1 致敏階段：將100 μg OVA與2 mg AL（OH）3溶于100 μL 生理鹽水配制OVA溶液。AR組和法舒地爾組小鼠分別于模型建立0、3、7、10 d腹腔注射OVA溶液（100 μL）。正常對(duì)照組小鼠相同時(shí)間注射等量生理鹽水。

1.2.2 激發(fā)階段：將500 μg OVA溶于10 μL生理鹽水配制OVA溶液。AR組和法舒地爾組小鼠于模型建立15～21 d OVA溶液滴鼻，每側(cè)鼻孔10 μL，連續(xù)7 d。法舒地爾組小鼠每次OVA溶液滴鼻激發(fā)前0.5 h腹腔注射法舒地爾（10 mg/kg），連續(xù)7 d。正常對(duì)照組處理時(shí)間同法舒地爾組，藥物均用等量生理鹽水替代。

末次鼻腔致敏后30 min 內(nèi)觀察小鼠打噴嚏、撓鼻、抓臉、鼻溢等癥狀。記分標(biāo)準(zhǔn)［10］：（1）鼻癢，輕搔鼻 1～ 2 次，1 分；劇烈抓撓鼻面不止，3分；介于二者之間，2 分。（2）噴嚏，1～ 3 個(gè)，1 分；4～ 10 個(gè)，2 分；11 個(gè)以上，3 分。（3）流涕，流至前鼻孔，1 分；超出前鼻孔；2 分；涕流滿(mǎn)面，3 分。以上各項(xiàng)指標(biāo)均采用疊加量化記分法。總分＞5分表示AR模型建立成功。

1.3 組織切片及染色

各組選取2只小鼠于末次激發(fā)后2 h處死，然后取鼻黏膜投入4%多聚甲醛中固定，包埋成蠟塊，蠟塊切片（厚度5 μm）。HE染色，鏡檢觀察。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

末次激發(fā)2 h后小鼠脫頸椎處死、斷頭。迅速打開(kāi)鼻腔，取出鼻黏膜后立即投入液氮凍融。應(yīng)用Trizol試劑提取小鼠鼻黏膜組織細(xì)胞總RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA的質(zhì)量濃度及鑒定純度。使用RT試劑盒將0.1 ng～5 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用ABI7500實(shí)時(shí)PCR檢測(cè)。引物序列：IFN-γ，上游引物5’-ATGAACGCTACACACTGCATC-3’；下游引物5’-CCATCCTTTTGCCAGTTCCTC-3’。IL-4，上游引物5’-GGTCTCAACCCCCAGCTAGT-3’；下游引物5’-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGAT-3’。IL-17，上游引物5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’；下游引物5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’。Foxp3，上游引物5’-CCCATCCCCAGGAGTCTTG-3’；下游引物5’-ACCATGACTAGGGGCACTGTA-3’。β-actin，上游引物5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’；下游引物5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad prism 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以表示，2組比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，3組比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組小鼠癥狀比較

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AR組小鼠AR癥狀明顯（P＜ 0.05）；與AR組比較，法舒地爾組AR癥狀明顯減輕（P＜ 0.05），見(jiàn)表1。

2.2 各組小鼠鼻黏膜HE染色結(jié)果

光鏡下結(jié)果顯示，AR組黏膜可見(jiàn)明顯腫脹及大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)。與AR組比較，法舒地爾組鼻黏膜腫脹減輕，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少。而對(duì)照組未見(jiàn)黏膜腫脹及嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

2.3 各組小鼠鼻黏膜中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA 及Foxp3 mRNA表達(dá)

結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，AR組IL-4mRNA、IL-17mRNA表達(dá)明顯升高，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA表達(dá)明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。與AR組比較，法舒地爾組IL-4mRNA表達(dá)明顯降低，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA、IL-17mRNA表達(dá)明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05）。見(jiàn)表2。

表1 各組小鼠末次鼻腔致敏后30 min內(nèi)過(guò)敏癥狀比較Tab.1 Comparison of allergic symptoms within 30 minutes after the last nasal sensitization in each group

圖1 各組小鼠鼻黏膜HE染色結(jié)果×40Fig.1 HE staining results of the nasal mucosa in each group × 40

3 討論

AR是由炎癥細(xì)胞和免疫細(xì)胞參與的變態(tài)反應(yīng)。針對(duì)某種變應(yīng)原的特異性IgE［13］抗體是引起Ⅰ型超敏反應(yīng)的主要因素。CD4+T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子調(diào)節(jié)IgE的表達(dá)［14］。

CD4+T細(xì)胞包括Th1、Th2、Th17、Treg等。其中Th2在過(guò)敏性疾病中起著關(guān)鍵作用［15］。Th1/Th2、Th17/Treg細(xì)胞失衡在AR患者的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［16］。Th1、Th2、Th17、Treg及其代表性的細(xì)胞因子（IFN-γ、IL-4、IL-7）和轉(zhuǎn)錄因子Foxp3之間存在著相互調(diào)節(jié)關(guān)系［17］。本研究結(jié)果表明，與對(duì)照組比較，AR組IL-4mRNA、IL-17mRNA表達(dá)明顯升高，IFN-γmRNA、Foxp3mRNA表達(dá)降低（均P＜ 0.05），與以往研究［18-19］結(jié)果一致。

Rho/ Rho激酶通路能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)，影響細(xì)胞遷移、運(yùn)動(dòng)［20］。Rho激酶抑制劑能阻礙巨噬細(xì)胞功能［21］。阻斷Rho激酶2活性可顯著抑制炎癥黏膜中的促炎性細(xì)胞因子［22］。本研究發(fā)現(xiàn)法舒地爾能夠抑制AR小鼠鼻黏膜的炎癥反應(yīng)，猜測(cè)可能是由于Rho激酶抑制劑抑制免疫細(xì)胞遷移、趨化并對(duì)免疫反應(yīng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，減少了AR小鼠鼻黏膜中嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)所致，與以往研究［23］結(jié)果一致。

表2 各組小鼠鼻黏膜中IFN-γ mRNA、IL-4 mRNA、IL-17 mRNA 及Foxp3 mRNA的表達(dá)Tab.2 Expression of IFN-γ mRNA，IL-4 mRNA，IL-17 mRNA and Foxp3 mRNA in the nasal mucosa of mice in each group

Rho激酶上游信號(hào)Rho-GDP酶激活認(rèn)為是免疫反應(yīng)協(xié)調(diào)的關(guān)鍵事件，阻斷Rho激酶2活性能抑制CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h1和Th17細(xì)胞，促進(jìn)了Treg細(xì)胞分化［22］。法舒地爾處理過(guò)的小膠質(zhì)細(xì)胞能夠顯著上調(diào)Treg細(xì)胞［24］。本研究結(jié)果表明法舒地爾對(duì)AR小鼠鼻黏膜免疫細(xì)胞的細(xì)胞因子表達(dá)水平均有影響，IL-4表達(dá)明顯降低，IFN-γ、Foxp3表達(dá)明顯升高。但本研究中法舒地爾治療后IL-17mRNA 表達(dá)水平卻異常升高，造成結(jié)果差異性的原因考慮可能和Th17的引物有關(guān)。

綜上所述，法舒地爾能減輕AR小鼠鼻黏膜的炎癥反應(yīng)，明顯降低IL-4表達(dá)水平，升高IFN-γ、Foxp3的表達(dá)水平，改善鼻黏膜局部Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡。但對(duì)于IL-17的影響趨勢(shì)有待于進(jìn)一步研究證實(shí)。