hMOF對子宮內(nèi)膜癌細胞生物學行為的影響

齊躍，葉秋霖，劉娟娟，林蓓

（中國醫(yī)科大學附屬盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科，沈陽 110004）

子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜上皮源性惡性腫瘤，占女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤的20%～30%。近年來，其發(fā)病率和病死率呈上升趨勢，發(fā)病年齡亦趨于年輕化［1］。組蛋白乙酰化修飾是重要的表觀遺傳學修飾之一，可通過改變某些特殊位點的組蛋白與DNA的某些區(qū)域結(jié)合的緊密性，從而改變相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，影響轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［2］。組蛋白乙酰化修飾受乙酰化酶和去乙酰化酶的雙重調(diào)節(jié)［3］，hMOF是組蛋白乙酰化酶三大家族中MYST家族的重要成員［4］，又被稱為MYST1或賴氨酸乙酰轉(zhuǎn)移酶8（lysine acetyltransferase 8，KAT8）。hMOF基因定位于人染色體16p11.2，編碼467個氨基酸，分子量52.4×103。hMOF參與胚胎發(fā)育、維護染色體的穩(wěn)定性［5］、DNA損傷修復［6-7］、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)等多種重要基礎(chǔ)生命過程，hMOF表達異常亦影響多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預后［8-9］。而hMOF在子宮內(nèi)膜癌中的表達情況尚未見報道。本研究采用小干擾RNA（small intefering RNA，siRNA）

技術(shù)抑制子宮內(nèi)膜癌細胞中hMOF的表達，檢測細胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力的改變，為組蛋白乙酰化修飾成為子宮內(nèi)膜癌新的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：人子宮內(nèi)膜癌細胞系Ishikawa購于中國科學院上海生命科學院細胞庫，由盛京醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室保存。

1.1.2 主要試劑：hMOF鼠抗人單克隆抗體（美國GeneTex公司）；GAPDH鼠抗人單克隆抗體、HRP標記山羊抗小鼠IgG、HRP標記山羊抗兔IgG（北京中杉金橋試劑公司）；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清（美國Gibco公司）；胰酶、DMSO（美國Sigma公司）；TRIzol試劑、Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑（美國Invitrogen公司）；MTT（中國Solarbio公司）；細胞周期試劑盒、Annexin-Ⅴ-APC/7AAD試劑盒（中國凱基公司）；Transwell小室、細胞培養(yǎng)板、培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿（美國Corning Coster公司）；BCA試劑盒（上海碧云天公司）；瓊脂糖（美國Promega公司）；PVDF膜（美國Millipore公司）；hMOF siRNA 片段和空白對照片段（上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞，在含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進行常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代1次，用0.25%胰蛋白酶進行細胞消化，取指數(shù)生長期細胞用于實驗。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染：取指數(shù)生長細胞接種于6孔板中，培養(yǎng)至融合度達到50%左右進行細胞轉(zhuǎn)染，按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進行，更換Opti-MEM培養(yǎng)基，加入含有干擾片段1.5 μg的培養(yǎng)基，混勻，加入促轉(zhuǎn)染試劑3.75 μL，避光室溫放置5 min，加入混合好的轉(zhuǎn)染復合物，搖勻，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，更換含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染72 h后檢測干擾效果，使用轉(zhuǎn)染48～72 h的細胞進行細胞學實驗。共設(shè)3組：對照組、空白轉(zhuǎn)染對照組（siRNA-NC組）和實驗組（siRNAhMOF組）。

1.2.3 Western blotting檢測hMOF蛋白水平：取指數(shù)生長期細胞，漂洗，加入細胞裂解液，冰上靜置裂解，刮取細胞，超聲波進一步裂解，離心，留取上清，采用BCA法測∶定細胞中的總蛋白濃度，按比例稀釋蛋白樣品，煮沸蛋白變性。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，蛋白上樣至孔槽中，每孔上樣量為50 μg，電壓為濃縮膠80 V、分離膠120 V條件下電泳。將PVDF膜在甲醇中浸泡5 min；4 ℃ 90 V電壓轉(zhuǎn)印1～3 h至PVDF膜。脫脂牛奶封閉，孵育一抗，hMOF鼠抗人單克隆抗體（1 ∶100），GAPDH鼠抗人單克隆抗體（1 ∶3 000），封膜，4 ℃搖床孵育過夜。室溫復溫，漂洗，孵育二抗，HRP標記的山羊抗小鼠IgG（1 ∶5 000）或山羊抗兔IgG（1 ∶5 000）室溫搖床孵育2 h。漂洗，顯色。Image J軟件測目的蛋白條帶相對蛋白表達量。

1.2.4 MTT法檢測細胞增殖能力：取指數(shù)生長期細胞，稀釋成濃度為3×103/mL的細胞懸液，接種于96孔板，每孔加入200 μL，細胞24 h充分貼壁伸展后加入小干擾試劑，繼續(xù)培養(yǎng)，分別于1、2、3、4 d，每孔加入20 μL MTT（5 mg/mL），繼續(xù)培養(yǎng)4 h，吸去培養(yǎng)液，加入150 μL DMSO，震蕩10 min，酶聯(lián)檢測儀檢測吸光度（490 nm）。每組設(shè)3個重復孔，實驗重復3次，以吸光度為縱坐標制作細胞生長曲線。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡：采用Annexin-Ⅴ-APC/7AAD雙染法檢測細胞凋亡，按凋亡試劑盒說明書操作，用不含EDTA的胰酶消化細胞，收集細胞沉淀，重懸細胞，先后加入5 μL APC染劑和7AAD染劑，孵育，上機檢測存活、早期凋亡、晚期凋亡和死亡細胞百分比。實驗重復3次。

1.2.6 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：取指數(shù)生長細胞接種于6孔板，融合度達90%，用移液槍頭（10 μL）在孔板中心劃取直線劃痕，PBS輕柔沖洗，更換無血清培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，分別在顯微鏡下觀察劃痕寬度并拍照。實驗重復3次。

1.2.7 Transwell實驗檢測細胞遷移能力：Transwell小室上室內(nèi)鋪Matrigel膠，干燥后，下室加入500 μL 5%胎牛血清培養(yǎng)基，上室加入200 μL無血清培養(yǎng)基細胞懸液（細胞數(shù)量2×105個），37 ℃孵育72 h后取出小室。多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色，用棉簽將上室擦凈，顯微鏡下計數(shù)下室濾膜面浸潤細胞數(shù)。實驗重復3次。

1.3 統(tǒng)計學分析

2 結(jié)果

2.1 siRNA干擾hMOF前后子宮內(nèi)膜癌細胞hMOF蛋白水平的變化

將子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞瞬時轉(zhuǎn)染siRNA靶向干擾hMOF，Western blotting檢測轉(zhuǎn)染前后hMOF蛋白水平的變化，結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組與siRNANC組相比hMOF蛋白水平明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），表明hMOF被有效沉默。見圖1。

圖1 Western blotting檢測siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細胞hMOF蛋白的表達水平Fig.1 Expression of hMOF before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by Western blotting

2.2 干擾hMOF表達前后子宮內(nèi)膜癌細胞增殖能力的變化

檢測干擾hMOF表達前后Ishikawa細胞在不同時間點（1、2、3、4 d）的OD值，并繪制增殖曲線。MTT實驗結(jié)果表明，4 d時siRNA-hMOF組與siRNA-NC組相比細胞增殖能力明顯下降（P＜ 0.01），siRNA-NC組與對照組相比無明顯差異。見圖2。

圖2 MTT實驗檢測siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細胞增殖能力的變化Fig.2 The proliferation ability before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by MTT assay

2.3 干擾hMOF表達前后子宮內(nèi)膜癌細胞凋亡的變化

采用流式細胞術(shù)檢測干擾hMOF表達前后Ishikawa細胞凋亡的變化，結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組細胞的早期凋亡率和晚期凋亡率（分別為5.18%和8.28%）較siRNA-NC組（分別為3.83%和4.98%）均增加，差異均有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05）。見圖3。

圖3 Annexin-Ⅴ-APC/7AAD雙染檢測siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細胞凋亡的變化Fig.3 The apoptosis rates before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by Annexin-Ⅴ-APC/7AAD assay

2.4 干擾hMOF表達前后子宮內(nèi)膜癌細胞遷移能力的變化

劃痕實驗檢測結(jié)果顯示，siRNA-hMOF組細胞遷移能力較siRNA-NC組明顯減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.05），siRNA-NC組與對照組相比無明顯差異。見圖4。

2.5 干擾hMOF表達前后子宮內(nèi)膜癌細胞侵襲能力的變化

siRNA-hMOF組與siRNA-NC組相比穿膜細胞數(shù)明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P＜ 0.001），siRNA-NC組與對照組相比無明顯差異。見圖5。

圖4 劃痕實驗檢測siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細胞遷移能力的變化Fig.4 The migration ability before and after transfection of siRNA-hMOF in Ishikawa cells detected by wound healing test

圖5 Transwell實驗檢測siRNA干擾hMOF前后Ishikawa細胞侵襲能力的變化Fig.5 The invasion ability before and after transfection of siRNAhMOF in Ishikawa cells detected by Transwell assay

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是女性生殖系統(tǒng)的三大惡性腫瘤之一，發(fā)病率呈逐年上升趨勢，并且逐漸趨于年輕化，但其發(fā)病機制目前仍不十分明確，進一步研究其腫瘤惡性生物學行為的分子機制尤為重要，探尋更為有效的治療靶點具有臨床意義。

近年來，有學者逐漸發(fā)現(xiàn)腫瘤并非全部由基因異常引起，表觀遺傳學即非DNA水平改變導致的基因表達水平變化亦在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，故越來越受到重視。組蛋白乙酰化酶與組蛋白去乙酰化酶二者共同作用，維持著特殊位點的組蛋白賴氨酸殘基的乙酰化水平的動態(tài)平衡，導致表觀遺傳學改變，從而調(diào)控某些基因的轉(zhuǎn)錄。hMOF是三大乙酰化酶家族中MYST家族中的重要成員。組蛋白有多個乙酰化位點，但人類的正常細胞中大約有60%的H4組蛋白僅發(fā)生16位賴氨酸單一位點的乙酰化，即多種疾病與該位點的乙酰化水平存在相關(guān)性。hMOF則能特異性乙酰化組蛋白H4K16位點［9-10］，與胚胎發(fā)育、維護染色質(zhì)結(jié)構(gòu)［9］、染色體穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)［5-7］、DNA損傷修復［6］等密切相關(guān)。可見，hMOF在多種基礎(chǔ)生理過程中起著調(diào)控作用，而hMOF酶活性的喪失可能在細胞惡性轉(zhuǎn)化過程中發(fā)揮著重要作用。

已有研究表明，hMOF的表達異常與多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后密切相關(guān)，但其在不同腫瘤中的表達并不完全相同。hMOF在某些腫瘤中表達增高，表現(xiàn)為致癌作用。有研究［11］發(fā)現(xiàn)，在非小細胞肺癌組織中hMOF和H4K16乙酰化水平較正常組織升高，hMOF能夠促進非小細胞肺癌細胞增殖、遷移、黏附，并通過Skp2促進腫瘤細胞進入S期，與腫瘤進展相關(guān)。還有研究［12］發(fā)現(xiàn)，hMOF介導Nrf2乙酰化，促進了非小細胞肺癌細胞的增殖和耐藥。前列腺癌研究［13］發(fā)現(xiàn)，hMOF與WDR5在雄激素受體靶基因上存在共定位，敲除hMOF基因后，顯著降低了雄激素受體靶基因的表達，且降低了前列腺癌細胞增殖。口腔舌鱗狀細胞癌研究［14］發(fā)現(xiàn)，hMOF在癌組織中呈高表達，且與不良預后相關(guān)，同時EZH2（Zeste基因增強子人類同源2）亦呈高表達，敲低hMOF降低了EZH2的表達，可見EZH2是hMOF的作用靶點之一。然而，hMOF在其他某些腫瘤中表達卻降低，表現(xiàn)為抑癌作用。腎癌、結(jié)直腸癌和胃癌研究［15］發(fā)現(xiàn)，hMOF蛋白和mRNA表達水平均明顯降低，與胃癌患者的生存時間存在相關(guān)性。腎透明細胞癌、乳腺癌和髓母細胞瘤研究［16-17］發(fā)現(xiàn)，hMOF的表達與H4K16位點的乙酰化水平均明顯降低，其表達下降是髓母細胞瘤患者預后的獨立危險因素。在腎透明細胞癌中，其表達還與臨床分期、病理分級密切相關(guān)［18］。在肝癌組織和細胞中hMOF蛋白和mRNA水平均顯著下降，hMOF低表達預示總生存和無病生存情況較差；敲低hMOF后則促進了肝癌細胞生長，過表達hMOF則抑制其生長［19］。本課題組的前期研究曾檢測卵巢癌組織中hMOF的表達，在上皮性卵巢癌中，其蛋白和mRNA水平均顯著降低，與分期存在密切相關(guān)；且hMOF高表達患者的生存時間明顯高于低表達患者，從而說明hMOF高表達在卵巢癌中是一種保護性因素［20］。可見，hMOF在多種惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，但其作用并不完全相同。

hMOF在子宮內(nèi)膜癌中的表達及其與腫瘤惡性生物學行為的關(guān)系尚未見報道，因此本研究在子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞中進行了檢測，發(fā)現(xiàn)hMOF呈高表達，本研究又將Ishikawa細胞瞬時轉(zhuǎn)染hMOF的小干擾片段，敲低hMOF后，表現(xiàn)為Ishikawa細胞的增殖能力明顯下降，早期凋亡率和晚期凋亡率均增加。本研究發(fā)現(xiàn)，hMOF與子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖存在相關(guān)。敲低hMOF后，Ishikawa細胞的遷移和侵襲能力均明顯下降。可見，hMOF同時又與腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移相關(guān)。

綜上所述，本研究通過siRNA技術(shù)構(gòu)建了hMOF低表達的子宮內(nèi)膜癌細胞系，以探討hMOF在子宮內(nèi)膜癌惡性生物學行為中的作用。本研究結(jié)果提示，干擾hMOF表達后，抑制了子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞的增殖、遷移和侵襲，促進了細胞凋亡。可見，hMOF在子宮內(nèi)膜癌的惡性進展中發(fā)揮重要作用，可能影響子宮內(nèi)膜癌預后。本研究僅局限在hMOF對子宮內(nèi)膜癌細胞體外惡性生物學行為的影響，與子宮內(nèi)膜癌的關(guān)系及其作用機制尚有待進一步深入研究，以期為子宮內(nèi)膜癌的治療尋找新的靶點。