ASB14通過調控泛素化介導的線粒體自噬改善小鼠心力衰竭

王澈，楊宏輝，李慶民，杜秋波，朱利杰，李清曼，張彩麗

（河南省人民醫院，阜外華中心血管病醫院，鄭州大學人民醫院心內科，鄭州 450000）

隨著我國人口老齡化的加快，心力衰竭的患病率逐年升高。心力衰竭誘發的心肌肥厚常伴隨著心肌細胞中蛋白質的分解及合成，保持蛋白質分解與合成之間的平衡是維持心臟功能的重要條件［1-3］。研究［4］證實，泛素蛋白酶體系統（ubiquitin proteasome system，UPS）在主動脈瓣狹窄模型中出現心肌泛素化蛋白水平升高，說明心衰過程中存在心肌泛素化過程。

線粒體自噬是一個特異性選擇的過程，受多種基因和蛋白調控［5］。研究［6］發現，心力衰竭模型中線粒體自噬不足可能會加重心肌損傷，同時E3泛素連接酶Parkin的低表達可能導致心肌細胞中線粒體功能的失調及心律失常的加重，說明泛素化降解介導的線粒體自噬在心力衰竭中發揮至關重要的作用。

錨蛋白重復序列和抑制細胞因子信號盒（ankyrin repeats and suppressor of cytokine signaling box，ASB）14是ASB家族中的成員之一，本研究旨在構建壓力負荷誘導的心力衰竭小鼠模型，利用ASB14基因的腺相關病毒轉染小鼠，上調其心臟組織中ASB14表達，探討ASB14參與心力衰竭發生及發展可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

SPF級C57BL/6雄性小鼠40只，體質量30～35 g，購自遼寧長生生物有限公司［SCXK（遼）：2017-0001］；小鼠分籠飼養，自由進食和飲水，室溫維持在20～25℃，每日光照12 h。在適應性飼養1周后，采用隨機數字法將小鼠隨機分為假手術（Sham）組、模型（Model）組、模型+ASB14-siRNA載體（siRNA）組及模型+ASB14腺相關病毒轉染（ASB14）組，每組10只。

1.2 主要試劑

ASB14腺相關病毒及ASB14-siRNA表達載體購自上海吉瑪生物科技有限公司；RNA逆轉錄試劑盒購自Fermentas公司；TransStart Top Green qPCR SuperMix購自北京全式金公司；ASB14及β-actin引物合成于北京奧科鼎盛生物科技有限公司；p62、ASB14、PINK1、Parkin、Mfn2、TIM23、COXIV及LC-3B抗體購于英國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 模型制備與處置：根據文獻［7］報道的方法，將ASB14腺相關病毒及ASB14-siRNA表達載體利用無菌PBS稀釋成濃度為1.0×1012μg/mL后，利用尾靜脈注射的方法注射到小鼠體內，每只200 μL，其余組小鼠給予等量的陰性病毒稀釋液。在注射3周后，除Sham組小鼠外，其余小鼠均根據文獻［8-9］報道的方法構建心力衰竭小鼠模型，具體方法如下：小鼠手術前24 h禁食不禁水，1.5 %戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，皮膚消毒、備皮后，將小鼠仰臥位固定于手術臺中，于左側第2～3肋間剪開皮膚，切口0.5～1 cm，用鑷子鈍性分離肌肉，暴露胸主動脈，于胸主動脈弓部下方0.5 cm處挑起胸主動脈，將注射器針頭平行放置于胸主動脈上，利用手術線結扎，抽出針頭，使胸主動脈縮窄，逐層縫合。Sham組打開胸腔后，手術線不結扎，其余步驟均與Model組相同。術后6 h內禁食不禁水。

1.3.2 超聲檢測心功能：于手術后第4周，利用小動物超聲心電圖機檢測各組小鼠心臟功能，將探頭在二維模式下置于胸骨前，檢測縮短分數（left ventricular shortening fraction，FS ）、射血分數（ejection fraction，EF %）、左心室舒張末期內徑（left ventricular end-diastolic diameter，LVEDd）、左心室收縮末期內徑（left ventricular late systolic diameter，LVEDs）和左心室舒張末期后壁厚度（left ventricular posterior wall thickness，LVPWd）。

1.3.3 HE染色：術后4周后，脫頸處死小鼠，取出心臟，于4 %多聚甲醛中固定，脫水、透明、石蠟包埋隨后切片，厚度5 μm左右，石蠟切片在室溫下稍微干燥后，置于60 ℃恒溫烤箱中烤干使用。切片用二甲苯脫蠟，梯度乙醇溶液水化，蒸餾水沖洗1 min；Harris蘇木精染液（60 ℃）染色5 min，流水洗去蘇木素液；l %鹽酸乙醇分化1～3 s，流水沖洗；1 %氨水洗5～10 s，流水沖洗；伊紅染液染色2 min，鏡下觀察顏色變化，流水沖洗；梯度乙醇脫水：80 %乙醇1 min，95 %乙醇1 min，無水乙醇1 min；二甲苯透明2 min，切片晾干，中性樹膠封片。每組小鼠選取6張切片標本，光鏡下觀察組織學改變。

1.3.4 Masson染色：石蠟切片常規脫蠟脫水后，Masson染色液染色5 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，5 %磷鎢酸染液染色10 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，0.5 %苯胺藍染色5 min，0.5 %醋酸水溶液沖洗，梯度乙醇脫水：80 %乙醇1 min，95 %乙醇1 min，無水乙醇1 min；二甲苯透明2 min，切片晾干，中性樹膠封片。每組小鼠選取6張切片標本，光鏡下觀察心肌纖維化情況。

1.3.5 實時PCR：利用TRIzol法提取心臟組織中總RNA，取各組小鼠心臟組織加入1 mL TRIzol進行勻漿，勻漿液置于離心管中；每管加入0.2 mL氯仿，冰浴5 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；取上層水相，加入0.5 mL 異丙醇，冰浴10 min。4℃，12 000 r/min離心10 min；棄上清，加入1 mL用DEPC處理的水配置的75%乙醇，洗滌沉淀。4℃，7 500 r/min離心5 min；棄上清，自然吹干后用0.01% DEPC溶解沉淀，待用。按照試劑盒說明書合成cDNA。取2 μL cDNA為模板，按照實時PCR說明書進行體外擴增，以β-actin作為內參，DNA引物序列如下：β-actin引物上游5’-GGGAAATCGTGCGTGACA T-3’，下游5’-TCAGG AGGAGCAATGATCTTG-3’；ASB14引物上游5’-TG CAGAAAGGAGCTGACGTT-3’，下游5’-GCAGGTGG CCTGAACTCTTA-3’。結果使用2-△△Ct法計算基因相對表達變化。反應體系50 μL，反應條件如下：在95 ℃預變性5 min，94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，循環30次，72 ℃ 1 min。

1.3.6 Western blotting：將心臟組織剪碎，提取總蛋白，4 ℃，12 000 r/min離心20 min，使用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白進行定量，進行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳，使用PVDF膜轉膜2 h，5%脫脂奶粉封閉液封閉1 h，TBST洗膜，分別加入p62、ASB14、PINK1、Parkin、Mfn2、TIM23、COXIV、LC-3B及β-actin一抗（1 ∶1 000），TBST洗膜加入相應HRP標記二抗稀釋濃度為1 ∶1 000，室溫孵育1 h。TBST洗膜，ECL發光試劑盒發光，凝膠成像系統成像，Image J軟件計算灰度值，采用目的條帶與內參蛋白條帶光密度比值作為結果進行統計分析。

1.4 統計學分析

2 結果

2.1 各組小鼠ASB14 mRNA和蛋白的表達變化

取各組小鼠的心臟組織進行了實時 PCR及Western blotting檢測，與Sham組相比，siRNA組ASB14mRNA和蛋白表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜0.05）；而ASB14組ASB14mRNA和蛋白表達明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05），見圖1。

2.2 ASB14對心力衰竭小鼠心臟功能的影響

在模型建立后第4周，對小鼠進行了心臟超聲檢查。與Sham組相比，Model組FS、EF顯著降低，LVEDd、LVEDs和LVPWd明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；與Model組相比，siRNA組FS、EF進一步降低，且LVEDd、LVEDs和LVPWd也明顯增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；而轉染ASB14后能顯著增加FS、EF，并且降低LVEDd、LVEDs和LVPWd，與Model組相比差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表2。

表1 ASB14 mRNA及蛋白在小鼠心肌組織中的表達（）Tab.1 Expression of ASB14 mRNA and protein in mouse myocardial tissue（）

表1 ASB14 mRNA及蛋白在小鼠心肌組織中的表達（）Tab.1 Expression of ASB14 mRNA and protein in mouse myocardial tissue（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05.

圖1 Western blotting檢測各組ASB14蛋白表達Fig.1 ASB14 protein expression in each group was detected by Western blotting

2.3 ASB14對心力衰竭小鼠心臟病理損傷及纖維化的影響

HE染色結果（圖2）顯示，Sham組心肌纖維排列整齊，細胞核呈卵圓形，無皺縮、染色正常，未見心肌細胞肥大，無炎癥細胞浸潤現象；Model組及siRNA組小鼠心肌纖維排列紊亂，細胞核皺縮深染，心肌纖維肥大增厚，炎癥細胞浸潤，凋亡細胞多見，且siRNA組較Model組心臟病理損傷嚴重；ASB14組心肌纖維排列較Model組整齊，心肌細胞肥厚減輕，炎癥細胞及凋亡細胞減少，心臟病理損傷減輕。Masson染色結果顯示，與Sham組相比，Model組小鼠心肌纖維化程度明顯加重，膠原纖維表達明顯增多；與Model組相比，siRNA組小鼠膠原纖維表達也顯著增加；而轉染ASB14后，小鼠膠原纖維表達降低，纖維化程度減輕，提示ASB14能夠減輕心力衰竭小鼠心臟病理損傷及纖維化程度。

2.4 ASB14對心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達的影響

Western blotting檢測各組小鼠心肌組織中泛素化相關蛋白的表達，與Sham組相比，Model組小鼠心肌組織中泛素化相關蛋白PINK1、Parkin表達明顯增加，Mfn2表達明顯降低，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；轉染ASB14-siRNA后小鼠心肌組織中泛素化相關蛋白PINK1、Parkin表達顯著降低，Mfn2表達明顯增加，與Model組相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；此外，轉染ASB14后小鼠心肌組織中泛素化相關蛋白PINK1、Parkin表達進一步增加，Mfn2表達也顯著降低，與Model組相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表3，圖3。

表2 ASB14對心力衰竭小鼠心功能及心室擴張的影響（）Tab.2 Effects of ASB14 on cardiac function and ventricular dilation in mice with heart failure（）

表2 ASB14對心力衰竭小鼠心功能及心室擴張的影響（）Tab.2 Effects of ASB14 on cardiac function and ventricular dilation in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

圖2 ASB14對心力衰竭小鼠心臟病理損傷及纖維化的影響 HE×200Fig.3 Effect of ASB14 on cardiac pathological damage and fibrosis in mice with heart failure HE×200

2.5 ASB14對心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、LC-3B及p62表達的影響

Western blotting檢測各組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關蛋白的表達。與Sham組相比，Model組小鼠心肌組織中線粒體自噬相關蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白明顯降低，而LC3II/LC3I的比例顯著增加，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；轉染ASB14-siRNA后小鼠心肌組織中線粒體自噬相關蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白明顯增加，而LC3II/LC3I的比例顯著降低，與Model組相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05）；此外，轉染ASB14后小鼠心肌組織中線粒體自噬相關蛋白TIM23、COXIV及p62蛋白表達進一步減少，而LC3II/LC3I的比例顯著增加，與Model組相比，差異有統計學意義（P＜ 0.05）。見表4，圖4。

圖3 Western blotting檢測各組PINK1、Parkin及Mfn2蛋白表達Fig.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure

表3 ASB14對心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達的影響（）Tab.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure（）

表3 ASB14對心力衰竭小鼠PINK1、Parkin及Mfn2表達的影響（）Tab.3 Effect of ASB14 on the expression of PINK1，Parkin，and Mfn2 in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

3 討論

心力衰竭是多種心血管疾病的終末階段，其發病可能與心臟超負荷、心肌損傷以及心肌炎癥等因素有關［10］。ASB14是ASB家族中的成員之一，ASB14是心力衰竭的潛在標志物，其可能通過蛋白質泛素化參與心力衰竭的進展［11-12］。因此，本研究利用ASB14腺相關病毒或ASB14-siRNA轉染小鼠以促進或抑制心肌細胞中ASB14的表達，并通過主動脈縮窄手術建立壓力負荷誘導的心力衰竭小鼠模型，探討ASB14對心力衰竭小鼠的影響極其作用機制。研究結果發現，小鼠轉染ASB14腺相關病毒或ASB14-siRNA載體后，心肌內ASB14 mRNA及蛋白的表達明顯升高或降低，可用于后續研究。

表4 ASB14對心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、p62及LC3B表達的影響（）Tab.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXIV，p62 and LC3B in mice with heart failure（）

表4 ASB14對心力衰竭小鼠TIM23、COXIV、p62及LC3B表達的影響（）Tab.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXIV，p62 and LC3B in mice with heart failure（）

1）compared with sham group，P ＜ 0.05；2）compared with model group，P ＜ 0.05.

圖4 Western blotting檢測各組TIM23、COXⅣ、p62及LC3B蛋白表達Fig.4 Effect of ASB14 on the expression of TIM23，COXⅣ，p62，and LC3B in mice with heart failure

心肌細胞肥厚是心力衰竭患者的早期臨床表現，同時心肌細胞肥厚還會引起心肌細胞纖維增生，誘發心肌膠原纖維化。過量沉積的膠原纖維會使在正常情況下彼此聚合的心肌細胞分離開，心肌細胞之間的信息傳遞受到阻礙，心肌舒張及收縮功能受損，從而導致心肌泵血功能障礙［13-15］。本研究結果顯示，ASB14高表達能夠明顯改善壓力負荷誘導的心力衰竭小鼠心室功能不全及心室擴張、減輕心肌病理性損傷并減少膠原沉積，改善心肌纖維化。

心肌細胞肥厚伴隨著蛋白質的分解與重新合成，為了維持心肌內蛋白質分解及合成的相對平衡，UPS的泛素化過程會清除掉心肌內變異的蛋白質，維持心肌細胞蛋白質的分解與合成穩態［16-18］。Pink1是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，Parkin是一種E3泛素連接酶。當線粒體在受損狀態時，線粒體膜電位下降，Pink1在線粒體外膜迅速積累，導致Parkin向受損線粒體集聚，增加E3泛素連接酶的活性，加速受損線粒體基質蛋白的泛素化［19-21］。Mfn2是Parkin的受體，當心肌受損后，Mfn2表達降低，從而組織了Parkin易位至線粒體內膜，導致其在受損的線粒體上集聚［22］。本研究結果發現，ASB14高表達能夠促進Pink1及Parkin的表達，降低Mfn2的表達，說明ASB14可以激活E3泛素連接酶的活性，啟動泛素化，加快其對變異蛋白質的清除。

有研究［23-25］表明，Parkin活性增加和啟動泛素化，會促進線粒體自噬。研究［26］顯示在心力衰竭患者的心臟組織線粒體中自噬相關蛋白LC3Ⅱ的表達明顯增加、p62的表達明顯降低，說明線粒體自噬可能與心力衰竭的發展有關。本研究通過Western blotting檢測線粒體內膜相關蛋白及自噬相關蛋白的表達來探討線粒體自噬的激活情況，結果發現，當壓力負荷誘導的心力衰竭小鼠模型高表達ASB14后，p62、TIM23、COXⅣ的表達明顯降低，而LC3Ⅱ的表達明顯增加，進一步說明了ASB14可能通過增加泛素化水平，激活線粒體自噬水平來改善小鼠心力衰竭。

綜上所述，本研究發現ASB14可能是通過激活了泛素化介導的線粒體自噬，從而發揮改善心力衰竭的作用。本研究初步探討了ASB14對心肌細胞泛素化及線粒體自噬的影響以及其在改善心力衰竭中的作用，為心力衰竭患者的治療提供了新的靶點。