長鏈非編碼RNA lnc-ZNF37A-2對肺癌細胞遷移和侵襲能力的影響

周發(fā)忱，舒鑫，周欣

（大連醫(yī)科大學(xué)1.附屬第一醫(yī)院胸外科，遼寧 大連 116011；2.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)教研室，遼寧 大連 116044）

肺癌具有高發(fā)病率和高死亡率，嚴重影響人類的生命健康。中國的肺癌發(fā)病率高于全球，新發(fā)病例約占全球肺癌新發(fā)病例的37%［1］。近年來肺癌的診斷和治療方法均有突破，但肺癌患者預(yù)后差仍是目前面臨的嚴峻問題，統(tǒng)計表明，只有約7%的肺癌患者生存期超過5年［2-3］。肺癌細胞的惡性增殖和遷移是肺癌患者死亡的主要原因。因此，對肺癌發(fā)生、發(fā)展以及轉(zhuǎn)移的機制進行探討，對改善肺癌患者預(yù)后、延長生存期具有重要意義。

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）是一類存在于真核生物基因組中轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的RNA分子，定位于細胞核或細胞質(zhì)，但大多數(shù)不翻譯成蛋白質(zhì)［4］。有研究［5-6］表明，lncRNA在多種疾病的發(fā)生、發(fā)展過程中均異常表達，其調(diào)控的基因表達可發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平，在細胞凋亡、周期、增殖、遷移和化學(xué)抗性中擔(dān)任重要角色。近年來lncRNA對腫瘤進展的調(diào)控作用受到廣泛關(guān)注，其既能作為原癌基因促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展，也能在腫瘤進展過程中起到抑制作用，發(fā)揮抑癌基因的功能［7-8］。然而，肺癌中l(wèi)ncRNA的詳細分子機制尚不明確，需要進行深入研究。

lnc-ZNF37A-2是2014年發(fā)現(xiàn)的一種新的lncRNA［9］，在易于發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌細胞（HCCLYM-H2）中高表達，與定位相鄰的可預(yù)測肺癌復(fù)發(fā)的H2AFY2基因共表達。但其在肺癌中的作用和機制目前仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)分析，采用癌癥基因組圖譜（The Cancer Genome Atlas，TCGA）數(shù)據(jù)庫，分析lnc-ZNF37A-2（AL133271.1）在不同分期肺癌組織中的表達差異和臨床意義，并通過細胞實驗初步探討lnc-ZNF37A-2對肺癌細胞A549遷移和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系：肺癌細胞株A549、H1299購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.1.2 主要試劑：RPMI 1640培養(yǎng)基和10%胎牛血清購自美國Hyclone公司；TRIzol試劑、PrimeScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR PCR Master Mix購自日本TaKaRa公司；siRNA-lnc-ZNF37A-2、陰性對照siRNA和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司；Transwell小室購自美國CORNING公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：將細胞培養(yǎng)于37 ℃、5%CO2的常規(guī)細胞培養(yǎng)箱，使用含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞貼壁且占滿培養(yǎng)皿底面積的80%～90%后傳代。

1.2.2 實時定量PCR（real-time quantitative PCR，qRT-PCR）：將細胞用PBS清洗3遍，TRIzol試劑提取細胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系根據(jù)說明書配置，合成cDNA后，將cDNA稀釋10倍，進行實時PCR，以2-ΔΔCt法定量分析，使用人GAPDH為內(nèi)參，RNA free H2O為陰性對照，實驗重復(fù)3次。GAPDH引物：上游5’-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3’，下游5’-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3’；lnc-ZNF37A-2引物：上游5’-TTGCCCTGGTGTGCTGCTTTG-3’，下游5’-AGTCCATCCTCATCCTCTCCCATG-3’。

1.2.3 細胞轉(zhuǎn)染：將細胞接種到6孔板中，培養(yǎng)24 h后密度達到70%，轉(zhuǎn)染。設(shè)立lnc-ZNF37A-2干擾組（si-lnc-ZNF37A-2組）、陰性轉(zhuǎn)染組（NC組）、空白對照組。將 Lipofectamine 2000與si-lnc-ZNF37A-2或si-NC混合（終濃度為100 nmol/L）構(gòu)建轉(zhuǎn)染體系，將混合液加入6孔板中，37 ℃培養(yǎng)4 h，更換RPMI 1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，即可進行后續(xù)實驗。lnc-ZNF37A siRNA：順義，5’-AGUGAUAAGUGAAAUGGUGCA-3’，反義，5’-CACCAUUUCACUUAUCACUUU-3’。

1.2.4 劃痕實驗檢測細胞遷移能力：采用傷口愈合測定法評估細胞的遷移能力。細胞以6×105/孔的密度鋪6孔板。當細胞生長到100%匯合時，使用200 μL移液管吸頭劃傷傷口。用PBS將培養(yǎng)板洗滌3次，以除去細胞碎片，然后將細胞培養(yǎng)于不含胎牛血清的不完全RPMI 1640培養(yǎng)基中，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)。光學(xué)顯微鏡下拍攝初始傷口和培養(yǎng)48 h后恢復(fù)區(qū)域。計算傷口愈合面積，每個實驗重復(fù)3次。

1.2.5 Transwell侵襲實驗檢測細胞侵襲能力：每個Transwell小室（孔徑為8 μm）的上室加入1 ∶4體積比的基質(zhì)膠與無血清培養(yǎng)基混合液100 μL，待基質(zhì)膠凝固后進行實驗，評估細胞的侵襲能力。待細胞長到適宜密度后無血清處理4 h；收集饑餓處理過的細胞，上室接種細胞5×104/孔，加入無血清培養(yǎng)基200 μL，下室加入700 μL完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)48 h；取出小室，PBS清洗3次，4%多聚甲醛室溫固定30 min；PBS清洗3次，晾干后加入600 μL 0.2%的結(jié)晶紫溶液，室溫染色30 min，用棉簽小心擦掉上室細胞，在正置光學(xué)顯微鏡下隨機選擇5個視野以計數(shù)細胞數(shù)量。每個實驗重復(fù)3次。

1.2.6 生物信息學(xué)分析：訪問GEPIA（http：//gepia.cancer-pku.cn）主頁，進入單基因分析中的Stage Plots頁面，能夠可視化分析不同分期的lnc-ZNF37A-2表達量。訪問starBase v3.0（http：//starBase.sysu.edu.cn）主頁，進入Pan-Cancer頁面，分析lnc-ZNF37A-2表達量與肺癌患者總生存期的關(guān)系。利用在線數(shù)據(jù)庫Co-LncRNA（http：//www.bio-bigdata.com/Co-LncRNA/）中肺癌數(shù)據(jù)集（GSE34329），查找與lnc-ZNF37A-2共表達的mRNA，并繪制共表達調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，之后將預(yù)測得到的共表達基因在CEGsFuncs菜單中進行GO和KEGG基因功能富集分析。利用starBase v3.0網(wǎng)站預(yù)測lnc-ZNF37A-2與ANAI1、FOXC2和TWIST1表達的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用GraphPad Prism 7.0軟件處理數(shù)據(jù)，不同病理分期表達差異的比較采用F檢驗；生存曲線比較采用log-rank（Mantel-Cox）檢驗；2組間比較采用配對樣本t檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson線性相關(guān)分析。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TCGA分析lnc-ZNF37A-2在肺癌組織中高表達

利用TCGA數(shù)據(jù)庫分析485例不同肺癌分期患者的組織樣本中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達的差異（圖1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lnc-ZNF37A-2在Ⅰ期患者中表達較低，在Ⅳ期患者中表達最高，提示lnc-ZNF37A-2在晚期肺癌組織中高表達，可能發(fā)揮癌基因的作用。

圖1 lnc-ZNF37A-2在不同病理分期的肺癌患者中的表達Fig.1 The expression of lnc-ZNF37A-2 for different pathological stages in lung cancer patients

2.2 lnc-ZNF37A-2表達與肺癌患者生存期的關(guān)系

應(yīng)用log-rank檢驗分析lnc-ZNF37A-2表達水平與肺癌患者總生存期的關(guān)系（圖2），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，lnc-ZNF37A-2表達對肺癌患者總生存期可能有影響，lnc-ZNF37A-2高表達的部分肺癌患者總生存期縮短（P=0.3）。

圖2 lnc-ZNF37A-2表達與肺癌患者預(yù)后的相關(guān)性Fig.2 Relationship between the expression of lnc-ZNF37A-2 and the prognosis of lung cancer patients

2.3 lnc-ZNF37A-2共表達的mRNA網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與基因富集分析

為了探究lnc-ZNF37A-2影響患者預(yù)后的原因，通過Co-LncRNA網(wǎng)站預(yù)測與lnc-ZNF37A-2相關(guān)的mRNA，共發(fā)現(xiàn)107個基因與lnc-ZNF37A-2共表達（圖3A）。對共表達的基因的生物過程（GO：BP）、細胞組分（GO：CC）、分子功能（GO：MF）進行功能富集分析（圖3B）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，共表達基因與幾個過程有關(guān)，如碳酸氫鹽運輸、細胞基質(zhì)黏附、小分子代謝過程、胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷應(yīng)答、細胞周期蛋白依賴性蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的調(diào)控。細胞外基質(zhì)受體相互作用、轉(zhuǎn)化生長因子β信號通路和氧化磷酸化調(diào)節(jié)的信號通路是富集的主要通路。提示lnc-ZNF37A-2在肺癌細胞侵襲、遷移活性的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

2.4 抑制肺癌細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達后細胞侵襲和遷移能力減弱

驗證siRNA對細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達的干擾效率，通過實時PCR檢測A549、H1229細胞中轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2后lnc-ZNF37A-2的表達，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與空白對照組和NC組比較，轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2的A549和H1229細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達明顯降低（圖4A），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001），說明該siRNA可沉默肺癌細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2的表達。

由于A549細胞中siRNA-lnc-ZNF37A-2沉默效率高，因此使用A549細胞株進行后續(xù)實驗。通過劃痕實驗檢測細胞遷移水平的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，A549細胞轉(zhuǎn)染siRNA-lnc-ZNF37A-2使其沉默后，細胞遷移能力明顯降低（圖4B），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.001）。通過Transwell侵襲實驗檢測抑制肺癌細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達后細胞侵襲能力的改變，結(jié)果表明，A549細胞中沉默lnc-ZNF37A-2后，與NC組比較，siRNA-lnc-ZNF37A-2組細胞的侵襲能力明顯降低（圖4C）（P＜ 0.001）。提示lnc-ZNF37A-2在肺癌細胞侵襲、遷移的調(diào)控中發(fā)揮重要作用。

圖3 lnc-ZNF37A-2共表達的mRNA網(wǎng)絡(luò)與基因富集分析Fig.3 The network of co-expressed mRNAs with lnc-ZNF37A-2 and gene enrichment analysis

3 討論

肺癌是發(fā)病率和死亡率很高的惡性腫瘤，主要原因為早期診斷難度較大，確診時多為中晚期并已經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，患者錯過了最佳手術(shù)時機，而且治療后易局部復(fù)發(fā)。但肺癌侵襲和轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制尚未完全明確，臨床研究推測與趨化因子刺激、基質(zhì)成分降解和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化等有關(guān)［10-12］。因此，早期準確評價腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的情況對有效治療和改善預(yù)后至關(guān)重要。

lncRNA起初被認為是基因組轉(zhuǎn)錄的“噪音”，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，大量具有生物學(xué)功能的lncRNA進入人們的視野。近來研究表明，lncRNA通過表觀遺傳學(xué)修飾、轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平以及可變剪接調(diào)控細胞周期、分化、凋亡等發(fā)揮生物學(xué)作用，如HOTAIR、AK126698、HOTTIP和TUG1等lncRNA明顯影響肺癌細胞增殖、遷移、凋亡、化療藥物敏感性等不同生物學(xué)功能［6，13-14］。以往研究［9，15］發(fā)現(xiàn)，在易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肝癌細胞H2中，lnc-ZNF37A-2（RP11-672F9.1）的表達量顯著增加，與lnc-ZNF37A-2共表達的鄰近基因H2AFY2與肺癌復(fù)發(fā)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ～Ⅲ期肺癌患者相比，lnc-ZNF37A-2在Ⅳ期肺癌患者中表達量上調(diào)，提示lnc-ZNF37A-2與肺癌的進展相關(guān)；且lnc-ZNF37A-2高表達的患者總生存期較短，提示其有望成為預(yù)測肺癌預(yù)后的指標。然后，通過富集分析與lnc-ZNF37A-2共表達的mRNA，推測lnc-ZNF37A-2與細胞黏附以及細胞外基質(zhì)受體相互作用相關(guān)，可能影響肺癌侵襲、轉(zhuǎn)移。通過體外細胞實驗探討lnc-ZNF37A-2對肺癌細胞A549侵襲、遷移的作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，抑制肺癌細胞中l(wèi)nc-ZNF37A-2表達，肺癌細胞侵襲和遷移能力顯著降低，表明lnc-ZNF37A-2可能通過促進細胞的侵襲和遷移參與肺癌的發(fā)展。

本研究仍有以下不足，首先是缺少機制證據(jù)說明這些結(jié)果直接相關(guān)；其次，lnc-ZNF37A-2對肺癌細胞增殖和藥物敏感性有何影響及可能的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍需進一步研究。

綜上所述，本研究利用大數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合細胞實驗發(fā)現(xiàn)lnc-ZNF37A-2在晚期肺癌組織中高表達，且與患者不良預(yù)后相關(guān)；沉默lnc-ZNF37A-2表達會減弱肺癌細胞的侵襲和遷移能力，此過程可能是通過調(diào)控腫瘤微環(huán)境中的細胞黏附和細胞外基質(zhì)受體相互作用實現(xiàn)的。

圖4 沉默lnc-ZNF37A-2的表達抑制肺癌細胞的侵襲和遷移能力Fig.4 Invasion and migration capability was inhibited after silencing lnc-ZNF37A-2 expression in lung cancer cells